基于癌抑制基因ＷＴ１的产物的癌抗原制造技术

本发明专利技术涉及Ｗｉｌｍｓ肿瘤癌抑制基因ＷＴ１的产物，以该氨基酸序列中包括与Ｉ类主要组织适合性抗原（ＭＨＣ）结合的锚定氨基酸在内的连续７～３０个氨基酸构成的肽作为有效成分的癌抗原，以及含有它们的癌疫苗。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及以Wilms肿瘤的癌抑制基因WT1的产物为基础的癌抗原。该癌抗原作为针对白血病、骨髓异形成综合症、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等血癌或实体瘤，例如胃癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、胚细胞瘤、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌等以及WT1表达的所有癌的抗癌疫苗上有用的。
技术介绍
用于排除异物的免疫机构一般包括与识别抗原作为抗原提示细胞作用的巨噬细胞、识别该巨噬细胞的抗原提示产生各种淋巴因子使其他T-细胞等活化的辅助T细胞、通过该淋巴因子的作用分化成抗体产生细胞的B淋巴细胞等有关的体液免疫以及接受抗原提示分化成的杀伤T细胞攻击破坏靶细胞的细胞免疫。现在，认为癌的免疫主要是与杀伤T细胞有关的细胞性免疫引起的。在杀伤T细胞引起的癌免疫中，识别以主要组织适合抗原(MajorHistocompatibility Complex，MHC)第I类与癌抗原形成的复合体形式提示的癌抗原的前体T细胞分化增殖生成的杀伤T细胞攻击破坏癌细胞。这时，癌细胞在其细胞表面提示MHC第I类抗原与癌抗原形成的复合体，它成为杀伤T细胞的靶细胞(Cur.Opin，Immunol.，5，709，1993；Cur.Opin，Immunol.，5，719，1993；Cell，82，13，1995；Immunol.Rev，146，167，1995)。作为靶细胞的癌细胞上通过MHC第I类抗原提示的上述癌抗原可以认为是癌细胞内合成的抗原蛋白质被细胞内蛋白酶处理生成的约8～12个氨基酸构成的肽(Cur.Opin，Immunol.，5，709，1993；Cur.Opin.Immunol.，5，719，1993；Cell，82，13，1995；Immunol.Rev.，146，167，1995)。现在，对于各种癌进行了抗原蛋白质的检索，证明是癌特异抗原的物质较少。Wilms肿瘤的癌抑制基因WT1(WT1基因)是根据对Wilms肿瘤、无红彩、泌尿生殖器异常、精神发达迟滞等并发的WAGR综合症的解析，作为Wilms肿瘤的一种原因基因从染色体11p13分离出的物质(Gessler，M.等，Nature，Vol.343，p.774-778(1990))，基因组DNA通过约50kb由10个外显子构成，其cDNA为约3kb。由cDNA推测出的氨基酸序列如序列号1所示(Mo1.Cell.Biol.，11，1707，1991)。WT1基因在人白血病中高度表达，用WT1反义低聚物(antisenseoligomer)处理白血病细胞能够抑制其细胞增殖(特开平9-104627号公报)等提示WT1基因可以促进白血病细胞的增殖。而且，WT1基因在胃癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、胚细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌等实体瘤中高度表达(特愿平9-191635)，判断出WT1基因是白血病和实体瘤中新的肿瘤标识物。但是，尚未证明WT1基因表达产物是作为癌疫苗有用的癌特异抗原。专利技术公开因此，本专利技术确认了WT1基因表达产物作为癌抗原的可能性，提供了一种新型癌抗原。本专利技术人为了解决上述问题进行了各种研究，结果合成了WT1基因表达产物的氨基酸序列中含有被预测在小鼠和人的I类MHC和II类MHC的结合中作为锚定氨基酸(anchor amino acid)起作用的至少1个氨基酸的连续7～30个氨基酸构成的多肽，确认这些肽与MHC蛋白质结合，同时确认与I类MHC抗原结合时诱导杀伤T细胞，而且对靶细胞具有杀细胞效果，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术提供小鼠WT1表达产物或含有其一部分的癌抗原。在优选的方式中，本专利技术提供以与WT1的cDNA对应的序列号1所示的氨基酸序列中包括用于与MHC抗原结合的锚定氨基酸在内的6～30个氨基酸构成的肽作为活性成分的癌抗原。而且本专利技术提供以与人WT1的cDNA对应的序列号2所示的氨基酸序列中包括用于与MHC抗原结合的锚定氨基酸在内的7～30个氨基酸构成的肽作为活性成分的癌抗原。本专利技术还提供含有上述癌抗原的癌疫苗。附图的简单说明附图说明图1表示实施例1中用Db126肽免疫的细胞与非免疫细胞在流式细胞测量法中CD4+细胞与CD8+细胞的比例。图2是比较实施例2中用Db126肽免疫的细胞对于用Db126肽脉冲的靶细胞和未脉冲的靶细胞的杀细胞作用。图3是与图2含义相同的图。图4中A表示实施例3中使用Db126肽诱导的CTL对于用Db126肽脉冲的T2细胞的杀细胞效果，B表示实施例3中使用WH187肽诱导的CTL对于用WH187肽脉冲的T2细胞的杀细胞效果。图5表示由Db126肽诱导的CTL的表面标识物通过FACS解析的结果(CD19细胞以及CD3细胞)。图6表示CD4细胞以及CD8细胞与图5同样的图。图7表示CD56细胞与图5同样的图。图8表示WH187肽诱导的CTL的表面标识物通过FACS解析的结果(CD19细胞和CD3细胞)。图9表示CD4细胞和CD8细胞与图8同样的图。图10表示CD56细胞与图8同样的图。图11表示抗HLA-A2.1抗体对Db126肽特异性CTL引起的对于用Db126肽脉冲的T2细胞的特异性细胞溶解的影响。图12是比较Db126肽特异性CTL对于表达WT1的靶细胞或不表达WT1的靶细胞的细胞溶解活性。a表示E∶T比为7.5∶1的情况下的结果，b表示E∶T比为15∶1的情况下的结果。图13是比较Db126肽特异性CTL对于先天表达WT1的肿瘤细胞(FBL3)或不表达WT1的肿瘤细胞(RMA)的细胞溶解效果。图14是比较Db126肽特异性CTL对于用WT1基因胞质转移的细胞以及未进行胞质转移的同一细胞的细胞溶解效果。图15表示I类抗H-2抗体对Db126肽特异性CTL的细胞毒性的影响。图16表示使用Db126肽作为疫苗使用，免疫小鼠时的体内免疫效果。图17表示将表达WT1的质粒作为DNA疫苗投给小鼠时的免疫效果。图18是图17的对照，是表示投给不表达WT1的质粒时不产生免疫效果的图。专利技术的实施方式本专利技术中，作为设计癌抗原肽时的基础，选择小鼠I类MHC的Kb和Db，以及HLA的A*0201，选择预测与它们具有高亲和性的肽。根据Immunogenetics Vol.41，p.178-228(1995)的记载，预测与Kb结合的锚定氨基酸是5号的Phe和Tyr以及8号的Leu和Met等，另外预测与Db结合的锚定氨基酸是5号的Asn以及9号的Met和Ile等。另外，已知癌细胞表面上I类MHC提示的癌抗原肽的大小为约8～12个。因此，本专利技术的癌抗原肽是序列号1所示WT1基因产物的氨基酸序列中包括锚定氨基酸在内的连续7～30个氨基酸构成的肽。氨基酸的数目优选为8～12个，例如8或9个。在本专利技术中，作为其具体例子，I类MHC与Kb结合的肽使用由8个氨基酸构成的下述肽Kb45 Gly Ala Ser AlaTyrGly SerLeu(序列号3)Kb330 Cys Asn Lys ArgTyrPhe LysLeu(序列号4)I类MHC与Db结合的肽使用由9个氨基酸构成的下述肽Db126 Arg Met Phe ProAsnAla Pro Tyr Leu(序列号5)Db221 Tyr Ser Ser AspAsn本文档来自技高网...

【技术保护点】
癌抗原，以癌抑制基因ＷＴ１的产物或其一部分肽作为活性成分。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：冈芳弘，杉山治夫，
申请(专利权)人：株式会社国际癌症免疫研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]