使用WNT和TGF-β抑制使前庭干细胞受控增殖/生成内耳毛细胞的方法技术

提供了使用与TGF‑β抑制剂组合的Wnt激动剂、GSK3‑α抑制剂或GSK3‑β抑制剂来诱导干/祖支持细胞的自我更新，包括诱导所述干/祖细胞增殖，同时在子代细胞中保持分化成毛细胞的能力的组合物和方法。

Controlled proliferation/generation of inner ear hair cells by vestibular stem cells inhibited by WNT and TGF-beta

A combination of Wnt agonists, GSK3 alpha inhibitors or GSK3 beta inhibitors combined with TGF beta inhibitors is provided to induce self-renewal of stem/progenitor supporting cells, including inducing the proliferation of the stem/progenitor cells while maintaining the ability to differentiate into hair cells in offspring cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用WNT和TGF-β抑制使前庭干细胞受控增殖/生成内耳毛细胞的方法相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2016年3月2日提交的美国申请62/302,799号和2016年3月3日提交的美国申请62/303,035号的优先权，所述申请各自通过引用以其整体并入。背景
本公开涉及用于诱导干/祖支持细胞(例如前庭细胞)的自我更新，包括诱导干/祖细胞增殖，同时在子代细胞中保持分化成组织细胞的能力的组合物和方法。相关技术描述干细胞展现出在体内生成多种细胞类型的非凡能力。除了胚胎干细胞之外，组织特异性干细胞也在发育期间以及成体的稳态和损伤修复中起到关键作用。干细胞通过增殖来自我更新，以及通过分化生成组织特异性细胞类型。不同干细胞的特性因组织而异，并且由其固有的遗传和表观遗传状态来决定。然而，不同干细胞的自我更新与分化之间的平衡全部受到严格控制。不受控制的自我更新可导致干细胞的过度生长并可能导致肿瘤形成，而不受控制的分化可耗尽干细胞池，导致维持组织稳态的能力受损。因此，干细胞持续不断地感受其环境并用增殖、分化或凋亡来适当响应。将合意的是，通过控制干细胞增殖和分化的时机和程度来驱动再生。用随时间而被清除的小分子来控制增殖将允许控制干细胞增殖和分化的时机和程度。引人注目地，来自不同组织的组织干细胞共享有限数量的用于调控其自我更新和分化的信号传导途径，尽管以非常依赖环境的方式。这些途径之一是Wnt途径。已知Wnt刺激驱动干细胞的增殖并且还使干细胞分化。取决于年龄，两种作用均已在耳蜗中见到(Shi等人，2104)。此外，已显示Wnt激活在椭圆囊中驱动增殖(Lu等人，2008)。已知若干干细胞基因牵涉Wnt刺激。这些基因中的一些包括Sox9、Sox2、Lgr5、Frizzled、Lgr4、Pax2、Pax6、Pax8和Bmi1。已显示Sox9和Sox2在发育中的前庭器官中具有差异和重叠的表达。Sox9标记支持细胞，而Sox2标记支持细胞和II型毛细胞(Mak等人，2009)。Lgr5在多种多样的组织中表达，并且已被鉴定为肠上皮(Barker等人，2007)、肾、毛囊和胃(Barker等人，2010；Haegebarth和Clevers，2009)中成体干细胞的生物标志物。例如，2011年首次公开了哺乳动物耳蜗毛细胞衍生自支持细胞(Chai等人，2011；Shi等人，2012)。Lgr5是Wnt/β-连环蛋白途径的已知组分，已显示其在分化、增殖和诱导干细胞特征中起主要作用(Barker等人，2007)。美国人中15％遭受听力受损，并且35％遭受与生活质量下降和严重降低的风险相关的前庭和平衡问题(Agrawal等人，2009)。来自创伤、衰老、耳毒性药物或先天性异常的感觉毛细胞损失是听力和平衡功能障碍中的主要因素(Wong和Ryan2015年的综述)。在哺乳动物中听觉毛细胞一旦损失就不会再生。已观察到前庭毛细胞的低水平再生(Burns等人，2012)，但并不完全补偿与衰老相关的细胞损失(Rauch等人，2001；Burns等人，2012)。受损毛细胞的再生将提供不同于假体装置的用于治疗当前无疗法的病况的途径。虽然毛细胞不在哺乳动物耳蜗中再生，但在低等脊椎动物中，由围绕毛细胞的被称为支持细胞的上皮细胞生成新的毛细胞。先前的工作已集中在通过使导致毛细胞形成的基因激活或强制表达来使支持细胞转分化成毛细胞，其中特别集中于增强Atoh1的表达的机制(Bermingham等人，1999；Zheng和Gao，2000；Izumikawa等人，2005；Mizutari等人，2013)。有趣的是，已显示经Atoh1载体转导的细胞获得了与低等脊椎动物中的毛细胞行为类似的“原始”表型(Kawamoto等人，2003；Huang等人，2009；Yang等人，2012、2013)，并且没有完全发育成真正的哺乳动物毛细胞。如所提及的，经由基因插入上调Atoh1已显示产生了以未在天生的耳蜗或前庭终器内发现的方式行为表现的非耳蜗细胞类型。另外，这些方法增加了毛细胞数量但减少了支持细胞数量。因为已知支持细胞具有专门的作用(Ramirez-Camancho，2006；Dale和Jagger，2010)，这些细胞的损失可在恰当的内耳功能方面引起问题。因此，对于在损伤之前保护毛细胞、在损伤之后保持/促进现存细胞的功能和在损伤之后使前庭支持细胞或毛细胞再生仍保持着长期迫切的需要。如下文所公开的，在某些实施方案中，本公开提供了用于预防和治疗前庭功能障碍的方法。附图简述图1显示了在如指示的各种培养基条件下三维(3D)培养物中集落的透射光图像(GF：生长因子EGF、IGF和FGF；C：CHIR99021；6：616452；V：VPA；N：Noggin)。图2显示了(i)Wnt激动(C)促进支持细胞/干细胞生长，(ii)Wnt激动(C)+TGF-β抑制(6)改善干细胞生长，和(iii)通过丙戊酸(VPA)的HDAC抑制抑制细胞生长。图3显示了克隆支持细胞集落的共焦图像，使用指示支持细胞的特征性肌动蛋白点阵(lattice)(红色)和干细胞/支持细胞标志物Sox9(绿色)。GFC6中生长的集落看上去大于GFC集落。图4显示了其中使用γ分泌酶抑制剂LY411575，使克隆集落分化成高纯度毛细胞群体的共焦图像。指示毛细胞，集落表达肌球蛋白VIIA(绿色)并且含有肌动蛋白毛束(红色)。图5显示了在GF的背景下，(i)Wnt激动(CHIR99021)促进支持细胞/干细胞生长，以及(ii)与单独的Wnt激动相比，Wnt激动(CHIR99021)+使用两种备选(alternative)TGF-β抑制剂(SB-431542和A-83-01)的TGF-β抑制生成更大的支持细胞/干细胞的集落。简单概述在一个方面中，本公开提供了通过促进干性(stemness)使干细胞受控增殖，以提供分化的子代细胞的增殖和产生的方法，其包括向细胞群体施用有效量的(i)Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂；和(ii)TGF-β抑制剂。因此，在本公开的各种方面之中，可注意到在细胞群体中激活Wnt途径，以提高该群体自我更新的能力(即，重复生成具有等同的增殖潜能和“细胞命运规定”潜能的子代细胞的能力)和分化的能力(即，生成指定用于分化的子代细胞的能力)的方法。在一种实施方案中，细胞群体是前庭支持细胞群体。在一些实施方案中，优选在群体成员中c-myc基因的上游激活Wnt途径，且不对该群体进行任何基因修饰。在一些此类实施方案中，优选通过瞬时诱导此类活性的小分子来激活Wnt途径。在某些实施方案中，通过本文所公开的Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂来激活Wnt途径。另外，支持细胞群体优选包括对于前庭器官的内源性支持细胞。在一些实施方案中，本公开的另一个方面是诱导前庭细胞群体所包含的干/祖支持细胞的自我更新的方法。即，诱导干/祖支持细胞增殖(即，分裂并形成子代细胞)，同时在子代细胞中保持分化成毛细胞的能力。相比之下，如果仅诱导干/祖支持细胞增殖(而不保持多潜能性)，则子代细胞将缺乏分化成毛细胞的能力。此外，仅实施预先存在的干/祖细胞群体的分化有可能耗尽干本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.扩增前庭组织中的前庭细胞群体的方法，其包括使所述前庭组织与(i)Wnt激动剂、GSK3‑α抑制剂或GSK3‑β抑制剂和(ii)TGF‑β抑制剂接触，以在所述前庭组织中形成扩增的细胞群体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.02 US 62/302799;2016.03.03 US 62/3030351.扩增前庭组织中的前庭细胞群体的方法，其包括使所述前庭组织与(i)Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂和(ii)TGF-β抑制剂接触，以在所述前庭组织中形成扩增的细胞群体。2.如权利要求1所述的方法，其中所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂和TGF-β抑制剂能够在干细胞增殖测定中将干细胞增殖测定细胞群体中的支持细胞的数量增加到至少10倍或至少50倍。3.如权利要求2所述的方法，其中所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂和/或TGF-β抑制剂能够在干细胞分化测定中由包含前庭支持细胞的细胞群体形成毛细胞。4.如权利要求1所述的方法，其中所述TGF-β抑制剂选自616452(Repsox)、Galunisertib(LY2157299)、EW-719、IN-1130、EW-7203、EW-7195、Repsox、SM16、R268712、GW788388、SB-431542、A-83-01和PF-03671148。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述前庭组织保持天然形态。6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述前庭组织在对象中。7.如权利要求6所述的方法，其中通过向所述对象经鼓膜施用所述组合物来实现所述使所述前庭组织与所述组合物接触。8.如权利要求6所述的方法，其中使所述前庭组织与所述组合物接触导致所述对象的改进的前庭功能。9.促进组织细胞的生成的方法，所述方法包括将(i)Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂和(ii)TGF-β抑制剂施用于干细胞群体或使其被施用于干细胞群体。10.如权利要求9所述的方法，其中所述组织细胞是前庭组织细胞。11.如权利要求9所述的方法，其中所述组织细胞是前庭毛细胞，其为I型和/或II型毛细胞。12.治疗对象的方法，所述对象患有与没有或缺乏某些组织细胞相关的疾病或处于发展与没有或缺乏某些组织细胞相关的疾病的风险，所述方法包括将(i)Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂和(ii)TGF-β抑制剂施用于所述对象或使其被施用于所述对象。13.如权利要求12所述的方法，其中所述组织细胞是前庭细胞。14.如权利要求13所述的方法，其中所述组织细胞是前庭毛细胞，其包含I型前庭毛细胞和/或II型前庭毛细胞。15.治疗对象的方法，所述对象患有前庭病况或处于发展前庭病况的风险，所述方法包括向所述对象施用(i)Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂和(ii)TGF-β抑制剂。16.如权利要求15所述的方法，其中所述化合物分散于生物相容性基质中。17.如权利要求16所述的方法，其中所述生物相容性基质是生物相容性凝胶或泡沫。18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其中向所述对象的前庭组织经鼓膜施用所述化合物。19.如权利要求1所述的方法，其中所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂选自CHIR99021、LY2090314、AZD1080和GSK3抑制剂XXII。20.如权利要求1所述的方法，其中所述TGF-β抑制剂选自616452(Repsox)、Galunisertib(LY2157299)、EW-719、IN-1130、EW-7203、EW-7195、SM16、R268712、GW788388、SB-431542、A-83-01和PF-03671148。21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括选自以下的另外试剂：Notch激活剂、HDAC抑制剂、BMP4拮抗剂、Sox2的上调剂、维生素D(骨化三醇)、维生素B(烟酰胺)、维生素A、维生素C(pVc)、Lgr4、p38/MAPK抑制剂、ROCK抑制剂、TGF-βRI激酶抑制剂、以及/或者Alk2、Alk4、Alk5和/或Alk7的抑制剂。22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)或其组合。23.药物组合物，其包含药学上可接受的载体以及(i)Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂和(ii)TGF-β抑制剂，其中使所述组合物适合于向中耳和/或内耳施用。24.如权利要求23所述的药物组合物，其中(i)和(ii)分散于生物相容性基质中。25.如权利要求24所述的药物组合物，其中所述生物相容性基质是生物相容性凝胶或泡沫。26.如权利要求23-25中任一项所述的药物组合物，其中使所述组合物适合于局部施用于圆窗膜。27.如权利要求23-25中任一项所述的药物组合物，其中使所述组合物适合于经鼓膜施用，任选经鼓膜施用于前庭组织。28.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂选自CHIR99021、LY2090314、AZD1080和GSK3抑制剂XXII。29.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述TGF-β抑制剂选自616452(Repsox)、Galunisertib(LY2157299)、EW-719、IN-1130、EW-7203、EW-7195、SM16、R268712、GW788388、SB-431542、A-83-01和PF-03671148。30.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其进一步包含选自以下的另外试剂：Notch激活剂、HDAC抑制剂、BMP4拮抗剂、Sox2的上调剂、维生素D(骨化三醇)、维生素B(烟酰胺)、维生素A、维生素C(pVc)、Lgr4、p38/MAPK抑制剂、ROCK抑制剂、TGF-βRI激酶抑制剂、以及/或者Alk2、Alk4、Alk5和/或Alk7的抑制剂。31.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其进一步包含表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)或其组合。32.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其包含泊洛沙姆。33.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述泊洛沙姆包含泊洛沙姆188和泊洛沙姆407中的至少一种或其混合物。34.如权利要求31或32所述的药物组合物，其中所述泊洛沙姆处于相对于所述组合物计介于约5重量％与约25重量％之间的浓度。35.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述泊洛沙姆处于相对于所述组合物计介于约10重量％与约23重量％之间的浓度。36.如权利要求34所述的药物组合物，其中所述泊洛沙姆处于相对于所述组合物计介于约15重量％与约20重量％之间的浓度。37.如权利要求35所述的药物组合物，其中所述泊洛沙姆处于相对于所述组合物计约17重量％的浓度。38.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述Wnt激动剂、GSK3-α抑制剂或GSK3-β抑制剂处于约0.01uM至1000mM、约0.1uM至1000mM、约1uM至100mM、约10uM至10mM、约1uM至10uM、约10uM至100uM、约100uM至1000uM、约1mM至10mM或约10mm至100mM的浓度；或者处于相对于其有效干性驱动剂浓度计约0.01至1,000,000倍、或相对于其有效干性驱动剂浓度计约0.1至100,000倍、或相对于其有效干性驱动剂浓度计约1至10,000倍、或相对于其有效干性驱动剂浓度计约100至5000倍、或相对于其有效干性驱动剂浓度计约50至2000倍、或相对于其有效干性驱动剂浓度计约100至1000倍、或相对于其有效干性驱动剂浓度计约1000倍的浓度比；或者处于约0.01nM至1000uM、约0.1nM至1000uM、约1nM至100uM、约10nM至10uM、约1nM至10nM、约10nM至100nM、约100nM至1000nM、约1uM至10uM或约10u...

【专利技术属性】
技术研发人员：W麦克莱恩，
申请(专利权)人：频率治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US