使用GSK-3-α抑制剂的受控增殖干细胞/产生内耳毛细胞的方法技术

提供了用于诱导干/祖支持细胞的自我更新的组合物和方法，包括在子代细胞中保持分化成毛细胞的能力的同时诱导干/祖细胞增殖，且包括任选地与分化抑制剂诸如Notch激动剂或HDAC抑制剂(例如，丙戊酸)组合使用GSK3‑α抑制剂、及其盐的组合物和方法。

Controlled Proliferation Stem Cells/Generation of Inner Ear Hair Cells Using GSK-3-alpha Inhibitors

Compositions and methods for inducing self-renewal of stem/progenitor support cells are provided, including induction of proliferation of stem/progenitor cells while maintaining the ability to differentiate into hair cells in offspring cells, and comprising combinations and methods of selectively using GSK3_alpha inhibitors and their salts in combination with differentiation inhibitors such as Notch agonists or HDAC inhibitors (e.g., valproic acid).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用GSK-3-α抑制剂的受控增殖干细胞/产生内耳毛细胞的方法相关申请的交叉引用本申请要求在35U.S.C.§119(e)下于2016年3月2日提交的美国申请号62/302,803和2016年3月3日提交的美国申请号62/303,099的优先权，它们中的每一篇通过引用整体并入。背景
本专利技术涉及用于诱导干/祖支持细胞的自我更新（包括诱导干/祖细胞增殖，同时在子代细胞中维持分化成组织细胞的能力）的组合物和方法。相关技术的描述干细胞在体内展现出惊人的产生多种细胞类型的能力。除了胚胎干细胞外，组织特异性的干细胞在发育期间以及在成年人的体内稳态和损伤修复中发挥关键作用。干细胞通过增殖而自我更新，以及通过分化而产生组织特异性的细胞类型。不同干细胞的特性随组织不同而变化，并且由其固有的遗传状态和表观遗传状态决定。但是，不同干细胞在自我更新和分化之间的平衡都受到严格控制。失控的自我更新可能导致干细胞的过度生长，并可能导致肿瘤形成，而失控的分化可能耗尽干细胞库，从而导致维持组织体内稳态的能力受损。因而，干细胞持续地感知它们的环境并适当地以增殖、分化或细胞凋亡做出应答。通过控制干细胞增殖和分化的时机和程度来驱动再生将是合乎需要的。用随时间被清除的小分子来控制增殖，将允许控制干细胞增殖和分化的时机和程度。值得注意的是，来自不同组织的组织干细胞共享有限数目的调节其自我更新和分化的信号传递途径，但是以非常依赖于环境的方式。这些途径中的一些是Wnt和GSK3-β途径。Lgr5在多种组织中表达，并且已被鉴定为多种组织中的成体干细胞的生物标志物，诸如肠上皮(Barker等人.2007)、肾、毛囊和胃(Barker等人,2010;Haegebarth&Clevers,2009)。例如，在2011年首次公开了哺乳动物内耳毛细胞源自LGR5+细胞(Chai等人,2011,Shi等人.2012)。Lgr5是Wnt/β-连环蛋白途径的已知组分，其已经被证实在分化、增殖和诱导干细胞特征中起主要作用(Barker等人.2007)。内耳毛细胞的永久性损伤会导致感音神经性听觉丧失，从而在大比例的人群中造成交流困难。毛细胞是转换听觉刺激的感受细胞。受损的毛细胞的再生为目前除了假体装置以外再无其它疗法的病症的治疗提供了途径。尽管毛细胞在哺乳动物耳蜗中不会再生，但是在低等脊椎动物中的新毛细胞由环绕毛细胞的上皮细胞（被称作支持细胞）产生。先前的工作已经聚焦于通过导致毛细胞形成的基因的活化或强制表达而使支持细胞转分化为毛细胞，特别聚焦于增强Atoh1的表达的机制(Bermingham等人,1999;Zheng和Gao,2000;Izumikawa等人,2005;Mizutari等人,2013)。令人感兴趣的是，已经证实用Atoh1载体转导的细胞会获得前庭表型(Kawamoto等人,2003;Huang等人,2009;Yang等人,2012,2013)，并且缺乏完整的发育。如提及的，已经证实通过基因插入而上调Atoh1会产生非耳蜗细胞类型，其行为方式在天然耳蜗中未发现。另外，这些方法会增加毛细胞数目，但减少支持细胞数目。由于已知支持细胞具有专门作用(Ramirez-Camancho2006,Dale和Jagger2010)，这些细胞的损失将对适当的耳蜗功能带来问题。因而，仍然存在长期感觉到的需求：在损伤前保护听觉细胞，在损伤后维持/促进现有细胞的功能，在损伤后再生结构（包括神经元和毛细胞），和在损伤后再生耳蜗支持细胞或毛细胞。如下面公开的，在某些实施方案中，本专利技术提供了用于预防和治疗听觉功能障碍的方法。附图说明图1A-1B显示了在多种条件下Lgr5-GFP内耳支持细胞的扩增。图1A显示了在含有与CHIR99021(C)（优先抑制GSK3β的分子）或AZD1080（优先抑制GSK3α的分子）组合的生长因子(GF)=[EGF、bFGF、IGF-1]、VPA(V)的培养基中培养10天的Lgr5-GFP内耳祖细胞的亮视野和GFP荧光图像。图1B显示了在含有与CHIR99021(C)（优先抑制GSK3β的分子）或AZD1080（优先抑制GSK3α的分子）组合的GF=[EGF、bFGF、IGF-1]、VPA(V)的培养基中培养10天的Lgr5-GFP内耳祖细胞的定量。图2A-2B显示了在多种条件下Lgr5-GFP内耳支持细胞的扩增。图2B显示了在含有与CHIR99021(C)（优先抑制GSK3β的分子）或GSK3抑制剂XXII（同样抑制GSK3α和GSK3β的分子）组合的GF=[EGF、bFGF、IGF-1]、VPA(V)的培养基中培养10天的Lgr5-GFP内耳祖细胞的亮视野和GFP荧光图像。图2B显示了在含有与CHIR99021(C)（优先抑制GSK3β的分子）或GSK3抑制剂XXII（其具有比CHIR99021更高的GSK3α-抑制偏好）组合的GF=[EGF、bFGF、IGF-1]、VPA(V)的培养基中培养10天的Lgr5-GFP内耳祖细胞的定量。图3显示了在离体处理的柯蒂氏器官中增加的数目的毛细胞。用GSK3-抑制剂XXII处理的柯蒂氏器官表现出增加的Lgr5-GFP表达，2排内毛细胞，和6排外毛细胞。这是相对于在耳蜗中通常见到的正常1排内毛细胞和3排外毛细胞的增加。图4显示了在噪音损伤的CBA/CaJ小鼠中的听力恢复。用丙戊酸和CHIR99021(CV)（其中与GSKα相比，CHIR99021优先抑制GSK3β）处理的动物在所有试验的频率表现出显著恢复(n=32)。用VPA(V)和GSK3-抑制剂XXII(具有比CHIR99021更高的GSK3α-抑制偏好的分子(n=6))处理动物。专利技术简述在一个方面，本专利技术提供了一种用于增殖干细胞的方法，其包括使细胞群体与有效量的GSK3-α抑制剂或其药学上可接受的盐接触。在某些实施方案中，所述方法还包括使所述细胞群体与分化抑制剂（例如，HDAC抑制剂或Notch激动剂）接触。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸。因此，在本专利技术的不同方面，可以注意到一种用于在细胞群体中活化Wnt途径以增加该群体的自我更新能力(即，重复产生具有相同增殖和“细胞命运指定”潜能的子代细胞的能力)和分化能力(即，产生被指定用于分化的子代细胞的能力)的方法。在一个实施方案中，所述细胞群体是耳蜗支持细胞群体。优选地，在该群体的成员的c-myc基因上游活化Wnt途径，而不对该群体进行任何遗传修饰。作为替代，优选地用瞬时诱导这种活性的小分子活化Wnt途径。另外，所述支持细胞群体优选地包括对柯蒂氏器官而言内源性的LGR5+支持细胞。本专利技术的另一个方面是一种用于诱导被耳蜗细胞群体包含的干/祖支持细胞的自我更新的方法。也就是说，诱导干/祖支持细胞增殖(即，分裂并形成子代细胞)，同时在子代细胞中保持分化为毛细胞的能力。相反，如果仅诱导干/祖支持细胞增殖(而不保持多潜能性)，则子代细胞将缺乏分裂为毛细胞的能力。此外，仅增强预先存在的干/祖细胞群体的分化具有耗尽干细胞库的潜力。优选地用瞬时诱导这种活性的小分子活化增殖。另外，在某些实施方案中，所述支持细胞群体优选地包括对柯蒂氏器官而言内源性的LGR5+支持细胞。在不同的实施方案中，用G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于扩增耳蜗组织中的耳蜗细胞群体的方法，所述方法包括使所述耳蜗组织与干细胞增殖剂接触以在所述耳蜗组织中形成扩增的细胞群体，所述干细胞增殖剂是GSK3‑α抑制剂或其药学上可接受的盐。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.02 US 62/302803;2016.03.03 US 62/3030991.一种用于扩增耳蜗组织中的耳蜗细胞群体的方法，所述方法包括使所述耳蜗组织与干细胞增殖剂接触以在所述耳蜗组织中形成扩增的细胞群体，所述干细胞增殖剂是GSK3-α抑制剂或其药学上可接受的盐。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述GSK3-α抑制剂能够在干细胞增殖测定中使干细胞增殖测定细胞群体中的Lgr5+细胞的数量增加至少约1.25、1.5、1.75、2、3、5、10或20倍，且任选地选自表1。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述GSK3-α抑制剂能够在干细胞分化测定中从包含Lgr5+细胞的细胞群体形成毛细胞。4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述耳蜗组织保持天然形态。5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述耳蜗组织是在受试者中。6.根据权利要求5所述的方法，其中通过将所述组合物经鼓膜地施用给所述受试者来实现使所述耳蜗组织与所述组合物接触。7.根据权利要求5所述的方法，其中使所述耳蜗组织与所述组合物接触导致所述受试者的改善的听觉功能。8.一种促进组织细胞产生的方法，所述方法包括：向干细胞群体施用或造成其被施用GSK3-α抑制剂或其药学上可接受的盐。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述组织细胞是耳蜗细胞。10.根据权利要求8所述的方法，其中所述组织细胞是内耳毛细胞。11.一种治疗受试者的方法，所述受试者具有与某些组织细胞的缺失或缺乏有关的疾病或处于发生所述疾病的风险中，所述方法给所述受试者施用或造成被施用GSK3-α抑制剂或其药学上可接受的盐。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述组织细胞是耳蜗细胞。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述组织细胞是内耳毛细胞。14.一种治疗具有听力损失或处于发生听力损失的风险中的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用GSK3-α抑制剂或其药学上可接受的盐。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述化合物分散在生物相容的基质中。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物相容的基质是生物相容的凝胶或泡沫。17.根据权利要求11-16中的任一项所述的方法，其中将所述化合物经鼓膜地施用至所述受试者的耳蜗组织。18.前述权利要求中的任一项所述的方法，所述方法还包括施用分化抑制剂。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述分化抑制剂选自HDAC抑制剂和Notch激动剂或其药学上可接受的盐。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸或其药学上可接受的盐。21.根据权利要求1-20中的任一项所述的方法，其中所述GSK3-α抑制剂具有至少约0.5倍或0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍或1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的GSK3-α/GSK3-β选择性比率。22.根据权利要求1-20中的任一项所述的方法，其中所述GSK3-α抑制剂具有针对GSK3-α和GSK3-β的效能，其中所述效能对于抑制GSK3-α和GSK3-β而言小于约100nM，或对于抑制GSK3-α和GSK3-β而言小于约50nM、20nM、10nM、5nM、2nM或小于约1nM。23.前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述GSK3-α抑制剂具有至少约10倍或15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、60倍、80倍、90倍或至少约100倍的GSK3-α/CDK选择性比率。24.前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述GSK3-α抑制剂具有至少约10倍或15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、60倍、80倍、90倍或至少约100倍的GSK3-α/MAPK选择性比率。25.前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述GSK3-α抑制剂具有至少约10倍或15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、60倍、80倍、90倍或至少约100倍的GSK3-α/ERK选择性比率。26.前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述GSK3-α抑制剂具有至少约10倍或15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、60倍、80倍、90倍或至少约100倍的GSK3-α/MEK选择性比率。27.前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述GSK3-α抑制剂包含在以下范围的GSK3-α效能：约1nM至约1000nM；约100nM至约1000nM；约10nM至约100nM；约1nM至约10nM。28.前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述GSK3-α抑制剂是GSK3抑制剂XXII或AZD1080或其药学上可接受的盐。29.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和干细胞增殖剂，所述干细胞增殖剂是GSK3-α抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述组合物适合施用至中耳和/或内耳。30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述GSK3-α抑制剂分散在生物相容的基质中。31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述生物相容的基质是生物相容的凝胶或泡沫。32.根据权利要求29-31中的任一项所述的药物组合物，其中所述组合物适合局部施用至圆窗膜。33.根据权利要求29-31中的任一项所述的药物组合物，其中所述组合物适合经鼓膜施用，任选地施用至耳蜗组织。34.前述权利要求中的任一项所述的药物组合物，其中所述GSK3-α抑制剂是GSK3抑制剂XXII或AZD1080或其药学上可接受的盐。35.前述权利要求中的任一项所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含分化抑制剂。36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述分化抑制剂选自HDAC抑制剂和Notch激动剂或其药学上可接受的盐。37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸或其药学上可接受的盐。38.前述权利要求中的任一项所述的药物组合物，其中所述GSK3-α抑制剂具有至少约0.5倍或0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍或1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的GSK3-α/GSK3-β选择性比率。39.前述权利要求中的任一项所述的药物组合物，其中所述GSK3-α抑制剂具有针对GSK3-α和GSK3-β的效能，其中所述效能对于抑制GSK3-α和GSK3-β而言小于约100nM，或对于抑制GSK3-α和GSK3-β而言小于约50nM、20nM、10nM、5nM、2nM或小于约1nM。40.前述权利要求中的任一项所述的药物组合物，其中所述GSK3-α抑制剂具有至少约10倍或15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、60倍、80倍、90倍或至少约100倍的GSK3-α/CDK选择性比率。41.前述权利要求中的任一项所述的药物组合物，其中所述GSK3-α抑制剂具有至少约10倍或15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、60倍、80倍、90倍或至少约100倍的GSK3-α/MAPK选择性比...

【专利技术属性】
技术研发人员：C卢斯，W麦克莱恩，M哈里森，
申请(专利权)人：频率治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US