神经类器官组合物及使用方法技术

本发明专利技术提出一种在体外模拟脑(如，人脑)的大多数特征的神经类器官，以及使用这一神经类器官来研究疾病和鉴定用于治疗神经系统疾病和病变的治疗剂的方法。

Composition of nerve organs and its application method

The present invention provides a neurological organ that simulates most of the characteristics of the brain (e.g., human brain) in vitro, and a method of using this neurological organ to study diseases and identify therapeutic agents for treating nervous system diseases and lesions.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】神经类器官组合物及使用方法相关申请的交叉引用本申请主张下述美国临时专利申请：2016年1月14日提交的US62/278,857和2016年2月23日提交的US62/298,872的权益，该临时专利申请的整体内容通过引用并入本文。
技术介绍
将近三分之一的成年人在其生命中，至少一次收到神经发育疾病、神经精神系统疾病或神经系统疾病(如，孤独症、焦虑、心境障碍、神经变性疾病)的影响。美国和欧洲用在脑病上的费用大约为每年数百亿美元。神经系统科学典型依赖于对活体脑或组织样品的实验操作，但科学进展受限于大量因素。由于伦理和技术的原因，大多数侵入性技术不可能用于人类。动物实验昂贵，且从动物身上获得的结果必需在长期且昂贵的人类临床试验中得以证实。亟需改善的人脑实验模型来理解疾病机制和测试潜在的疗法。
技术实现思路
如下文所述，本专利技术提出一种在体外模拟脑(如，人脑)的大多数特征的神经类器官，以及使用这一神经类器官来研究疾病和鉴定用于治疗神经系统疾病和病变的治疗剂的方法。一方面，本专利技术提出一种体外生成的源自人诱导多能干细胞(hIPSC)的三维神经类器官，该类器官包含表达视黄醛或皮层标记物的第一区域以及一个或多个各自表达脑干、小脑、及/或脊髓的标记物的其它神经区域。一种具体实施例中，该类器官包含表达一种或多种神经标记物的细胞以及表达选自星形细胞标记物、少突细胞标记物、小神经胶质细胞标记物、及/或血管标记物所组成组的标记物的细胞。另一具体实施例中，该hIPSC包含与神经系统缺陷相关的基因突变。另一具体实施例中，该基因突变是在TSC1、TSC2、PSEN1、或APP中。一方面，本专利技术提出一种体外生成的源自人诱导多能干细胞的三维神经类器官，该类器官包含表达神经标记物的第一细胞类型和表达星形细胞标记物、少突细胞标记物、小胶质神经细胞标记物、或血管标记物的第二细胞类型。一种具体实施例中，该视网膜标记物是视网膜特异性鸟苷酸环化酶(GUY2D、GUY2F)、视网膜和前神经褶皱同源框(RAX)、和含铜的视网膜特异性胺氧化酶2(retinaspecificAmineOxidase,CopperContaining2)(RAX)。另一具体实施例中，该神经标记物是作为双皮质素、NeuN、FOXP2、CNTN4、和TBR1的皮层标记物。另一具体实施例中，该神经标记物是选自酪氨酸羟化酶、囊泡单胺转运体2(VMAT2)、多巴胺活性转运体(DAT)和多巴胺受体D2(D2R)所组成组的多巴胺能神经元的标记物。另一具体实施例中，该神经标记物是ATOH1、PAX6、SOX2、LHX2、GRID2、或另一小脑标记物。另一具体实施例中，该神经标记物是SOX2、NeuroD1、DCX、EMX2、FOXG1、PROX1、或另一颗粒神经元标记物。另一具体实施例中，该神经标记物是FGF8、INSM1、GATA2、ASCL1、GATA3、或另一脑干标记物。另一具体实施例中，该神经标记物是作为HOXA1、A2、A3、B4、A5、C8、或D13的同源框。另一具体实施例中，该神经标记物是NKCC1、KCC2、或另一GABA能标记物。另一具体实施例中，该星形细胞标记物是GFAP，该少突细胞标记物是OLIG2或MBP，该小神经胶质细胞是AIF1或CD4，且该血管标记物是NOS3。另一方面，本专利技术提出一种获得神经类器官的方法，该方法包括：从人诱导多能干细胞(hIPSC)和γ辐射鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞(MEF)的混合培养物中选择最低限度粘附的hIPSC，并在促进球形成的条件下培养该IPSC，以获得拟胚体(EB)；将该EB转移至培养板，并在诱导神经外胚层分化的条件下培养；将该EB在包含生长因子的三维基质中在静止条件下培养约3至5天；将该EB在三维基质中在促进生长介质层流的条件下培养，从而获得神经类器官。另一方面，本专利技术提出一种获得神经类器官的方法，该方法牵涉：单独或在已辐射MEF的存在下培养iPSC；在促使胚层分化的条件下，在低附着U底培养板中，在ROCK抑制剂和bFGF的存在下，将来自步骤(a)的iPSC培养约4天，且随后在缺少ROCK抑制剂或bFGF的培养基中培养该iPSC，以成形；在促使神经诱导的条件下将来自(b)的iPSC置于低附着培养板中，并从该拟胚体中选择显示神经外胚层长出的拟胚体；将所选择的拟胚体包埋入三维培养基质中，并在促使神经类器官发育的条件下培养，同时，每天轻柔地震荡该培养液2至3次；以及，静止地培养该神经类器官。在上述方面的多种具体实施例中，在该方法的每一步骤中，将储存在令氧化作用最小化的条件下的β-巯基乙醇加入该培养基中。其它具体实施例中，该培养物每天轻柔震荡两次，每次约1至5(如，1、2、3、4、5)分钟，以诱导培养基在培养物中的缓慢层流。其它具体实施例中，优化三维培养基质的量，以隔绝成形素和生长因子但允许营养物质和气体的交换。另一具体实施例中，该拟胚体被包埋在约10、20、或30μl的三维培养基质中。其它具体实施例中，令该MEF粘附至基板，随后移除未粘附的hIPSC，从而选择该hIPSC。其它具体实施例中，该三维基质是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肉瘤细胞提取的溶解的基底膜制备物。另一方面，本专利技术提出一种根据前述任何方面生成的体外来源的神经类器官，其中，该类器官包含表达视网膜标记物和皮层标记物的第一区域以及一个或多个表达中脑、脑干、小脑、及/或脊髓的标记物的额外区域。本专利技术界定的组合物和物品是分离的或以其它方式制造的。从详细说明书和权利要求书中，本专利技术的其它特征和优点显而易见。定义除非另做定义，本文中使用的所有科技术语均具有本专利技术所属领域技术人员所一般理解的意义。下述参考文献向技术人员提供本专利技术中众多术语的定义：Singletonetal.,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(2nded.1994)；TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology(Walkered.,1988)；TheGlossaryofGenetics,5thEd.,R.Riegeretal.(eds.),SpringerVerlag(1991)；和Hale&Marham,TheHarperCollinsDictionaryofBiology(1991)。本文中，除非明确排除，下述术语具有其下方所述的意义。“淀粉样前体蛋白”意为，与阿尔兹海默症关联蛋白NCBIRefSeq.NP_001129488或其片段的一致性为至少约85％的蛋白。一种具体实施例中，APP序列在阿尔兹海默症中被复制。例示性APP序列提供如下：“APP多核苷酸”意为编码APP蛋白的核酸分子。“类器官”意为，在体外生成的有组织的细胞类型团块，至少在某种程度上，该细胞类型团块反映天然器官的结构、标记物表达、或功能。“神经标记物”意为，其表达与神经细胞命运相关的任何蛋白质或多核苷酸。例示性的神经标记物包括与皮层、视网膜、小脑、脑干、颗粒神经元、多巴胺能神经元、和GABA能神经元相关的标记物。例示性的小脑标记物包括但不限于，ATOH1、PAX6、SOX2、LHX2、和GRID2。例示性的多巴胺能神经元本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外生成的源自人诱导多能干细胞(hIPSC)的三维神经类器官，该类器官包含表达视网膜标记物或皮层标记物的第一区域以及一个或多个各自表达脑干、小脑、及/或脊髓的标记物的其它神经区域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.14 US 62/278,857;2016.02.23 US 62/298,8721.一种体外生成的源自人诱导多能干细胞(hIPSC)的三维神经类器官，该类器官包含表达视网膜标记物或皮层标记物的第一区域以及一个或多个各自表达脑干、小脑、及/或脊髓的标记物的其它神经区域。2.如权利要求1所述的类器官，其中，该类器官包含表达一种或多种神经标记物的细胞以及表达选自星形细胞标记物、少突细胞标记物、小神经胶质细胞标记物、及/或血管标记物所组成组的标记物的细胞。3.如权利要求1所述的类器官，其中，该hIPSC包含与神经系统缺陷相关的基因突变。4.如权利要求1所述的类器官，其中，该基因突变是在TSC1、TSC2、PSEN1、或APP中。5.一种体外生成的源自人诱导多能干细胞的三维神经类器官，该类器官包含表达神经标记物的第一细胞类型和表达星形细胞标记物、少突细胞标记物、小胶质神经细胞标记物、或血管标记物的第二细胞类型。6.如权利要2至5任一项所述的神经类器官，其中，该神经标记物是选自视网膜特异性鸟苷酸环化酶(GUY2D、GUY2F)、视网膜和前神经褶皱同源框(RAX)、和含铜的视网膜特异性胺氧化酶2(RAX)所组成组的视网膜标记物。7.如权利要2至5任一项所述的神经类器官，其中，该神经标记物是选自双皮质素、NeuN、FOXP2、CNTN4、和TBR1所组成组的皮层标记物。8.如权利要2至5任一项所述的神经类器官，其中，该神经标记物是选自酪氨酸羟化酶、囊泡单胺转运体2(VMAT2)、多巴胺活性转运体(DAT)和多巴胺受体D2(D2R)所组成组的多巴胺能神经元的标记物。9.如权利要2至5任一项所述的神经类器官，其中，该神经标记物是ATOH1、PAX6、SOX2、LHX2、GRID2、或其它小脑标记物。10.如权利要2至5任一项所述的神经类器官，其中，该神经标记物是SOX2、NeuroD1、DCX、EMX2、FOXG1、PROX1、或其它颗粒神经元标记物。11.如权利要2至5任一项所述的神经类器官，其中，该神经标记物是FGF8、INSM1、GATA2、ASCL1、GATA3、或其它脑干标记物。12.如权利要2至5任一项所述的神经类器官，其中，该神经标记物是选自HOXA1、A2、A3、B4、A5、C8、或D13所组成组的同源框基因。13.如权利要2至5任一项所述的神经类器官，其中，该神经标记物是NKCC1、KCC2、或另一GABA能标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·阿南德，S·麦凯，
申请(专利权)人：俄亥俄州国家创新基金会，
类型：发明
国别省市：美国,US