谷氨酸氧化酶突变体、核酸分子及应用和制备酮戊二酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种谷氨酸氧化酶突变体、核酸分子及应用和制备酮戊二酸的方法。该谷氨酸氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该谷氨酸氧化酶突变体可以催化谷氨酸形成酮戊二酸，其相较于野生型的谷氨酸氧化酶具有更高的催化能力。

Glutamate oxidase mutant, nucleic acid molecule and its application and preparation method of ketoglutarate

The invention discloses a glutamate oxidase mutant, a nucleic acid molecule and a method for preparing ketoglutarate. The amino acid sequence of the glutamate oxidase mutant is shown in SEQ ID NO.1. The glutamate oxidase mutant can catalyze glutamate to form ketoglutarate, which has higher catalytic ability than the wild glutamate oxidase.

【技术实现步骤摘要】
谷氨酸氧化酶突变体、核酸分子及应用和制备酮戊二酸的方法
本专利技术涉及酮戊二酸制备
，具体而言，涉及一种谷氨酸氧化酶突变体、核酸分子及应用和制备酮戊二酸的方法。
技术介绍
α-酮戊二酸(α-Ketoglutaricacid，α-KG)是一种重要的生物化合物。它是谷氨酸脱氨基的酮酸产物，并且是三羧酸循环的中间产物，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢。α-酮戊二酸在食品、医药、精细化工以及饲料行业有着广泛的用途。特别地，摩尔比为1：1的L-精氨酸α-酮戊二酸盐和摩尔比为2：1的L-精氨酸α-酮戊二酸盐是目前国际市场上销量日益增加的一种氨基酸盐类保健品，作为功能性营养强化剂和护肝药物，主要用作增强体格、促进肌肉的快速增长和恢复、促进肝细胞对营养和能量的吸收、维护肝功能正常等。现有α-酮戊二酸的生产工艺基本是以化学合成法和生物发酵法为主。化学合成法主要是以丁二酸二乙酯、草酸二乙酯等为原料，经缩合、水解合成α-酮戊二酸。例如张国基(中国专利技术专利申请公开号CN102584568A)以二氯乙酸甲酯和丙烯酸甲酯为原料，在甲醇钠存在的条件下，合成中间体2,2-二氯戊二酸二甲酯，再与碱溶液反应得到α-酮戊二酸水溶液粗品，精制后得到α-酮戊二酸产品。化学合成法生产α-酮戊二酸，虽然具有收率高、原料易得的特点，但反应过程中大量有机溶剂的使用，以及多步复杂的合成反应过程中会产生大量副产物从而增加分离成本，使得化学合成法总成本偏高、对环境不友好。相对于化学合成法，生物发酵法制备α-酮戊二酸，具有生产条件温和、工艺步骤简单、对环境友好等特点。国内对此研究较多，并申请了一系列的专利。江南大学的陈坚等人(中国专利技术专利申请公开号CN101245323A)利用重组菌发酵生产α-酮戊二酸，发酵时长48-72h，α-酮戊二酸产量达到18.6g/L；另一篇专利中(中国专利技术专利申请公开号CN101717735A)经过工艺和菌种的改进，α-酮戊二酸产量达到31.7g/L；在经过进一步的改进后(中国专利技术专利申请公开号CN102586128A)，α-酮戊二酸产量达到47.2g/L，发酵时长144h。天津科技大学的陈宁等人(中国专利技术专利申请公开号CN102391977A)利用谷氨酸棒杆菌发酵生产α-酮戊二酸，发酵32h，α-酮戊二酸产量最高可达47.2g/L。但是，生物发酵也有其缺点：生产周期长，产量低，产品与发酵液中多种成分混合在一起，导致提取与精制工艺复杂，总成本还是偏高。而生物酶法能很好地弥补发酵法的缺陷，极大地提高产品浓度、简化提取工艺、降低成本。LongLiu等人(LongLiu,GSHossain,etal.JournalofBiotechnology,2013,164:97-104)以L-谷氨酸为底物，利用L-氨基酸脱氨酶脱去氨基生成α-酮戊二酸，但其产量偏低，只有不到12.6g/L，而且反应存在产物抑制作用，目前还难以工业化。近年来采用全细胞催化剂来生产精细化工产品是非常高效的方法，相比较发酵法，具有生产周期短，效率高，产物相对单一的优点。相比较于酶法来说，工艺简单，无需纯化酶和固定化酶。2014年江南大学的陈坚等人(中国专利技术专利申请号201410132063.2)，采用全细胞转化生产a-酮戊二酸的方法，但是由于其采用的L-谷氨酸氧化酶的催化性质不够好，且转化率低，在24h内，转化率只有59.6％，产量为7.7g/L。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种谷氨酸氧化酶突变体，该谷氨酸氧化酶突变体可以催化谷氨酸形成酮戊二酸，其相较于野生型的谷氨酸氧化酶具有更高的催化能力。本专利技术的另一目的在于提供一种分离的核酸分子，其编码上述的谷氨酸氧化酶突变体。本专利技术的另一目的在于提供一种载体。本专利技术的另一目的在于提供一种重组菌。本专利技术的另一目的在于提供一种制备谷氨酸氧化酶突变体的方法。本专利技术的另一目的在于提供一种制备酮戊二酸的方法。本专利技术是这样实现的：一方面，本专利技术提供了一种谷氨酸氧化酶突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的专利技术人发现，上述谷氨酸氧化酶突变体，不仅保留了将谷氨酸催化形成酮戊二酸的活性，且其相较于野生型谷氨酸氧化酶具有更高的催化效率，达到了100％的催化效率。另一方面，本专利技术提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的谷氨酸氧化酶突变体。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述核酸分子的碱基序列如SEQIDNO.2所示。另一方面，本专利技术提供了一种载体，其含有上述的核酸分子。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述载体为pDK6质粒载体。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述核酸分子连接在pDK6质粒载体上EcoRl和Pstl酶切位点之间。另一方面，本专利技术提供了一种重组菌，其含有上述的载体。另一方面，本专利技术提供了一种制备上述谷氨酸氧化酶突变体的方法，其包括：培养上述重组菌。从培养产物中分离、纯化得到谷氨酸氧化酶突变体。得到的谷氨酸氧化酶突变体可以用于催化谷氨酸形成酮戊二酸。当然，在本专利技术的一些实施例中，也可以直接将培养物用于催化谷氨酸形成酮戊二酸。另一方面，本专利技术提供了上述的谷氨酸氧化酶突变体在催化谷氨酸形成酮戊二酸中的应用。另一方面，本专利技术提供了一种制备酮戊二酸的方法，其包括：使用上述的谷氨酸氧化酶突变体或上述的重组菌催化谷氨酸形成酮戊二酸。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为含谷氨酸氧化酶突变体编码基因的pDK6质粒图。图2为实施例中的发酵液经离心后获得去上清和沉淀的凝胶电泳图。图3为实验例中的酮戊二酸的液相色谱检测结果。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1构建表达谷氨酸氧化酶突变体的基因工程菌(1)在链霉菌谷氨酸氧化酶野生序列的基础上，进行人工设计，设计后的基因序列如SEQIDNO.2所示，其编码出的谷氨酸氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。将上述基因序列通过全基因合成的方法合成。(2)将合成的基因序列通过EcoRl和Pstl2个酶切位点克隆入pDK6质粒，将如上构建的质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体，命名为pDK6-12质粒(见图1)。(3)将重组表达载体pDK6-12质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达谷氨酸氧化酶突变体的基因工程菌。实施例2制备谷氨酸氧化酶突变体(1)将实施例1制得的用于表达链霉菌谷氨酸氧化酶突变体的基因工程菌在卡那霉素抗性的LB固体培养基上划线，于37℃生化培养箱中培养过夜，挑选较大的菌落接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于摇床37℃220rpm培养6～8h，或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种谷氨酸氧化酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸氧化酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的谷氨酸氧化酶突变体。3.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的碱基序列如SEQIDNO.2所示。4.一种载体，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的核酸分子。5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为pDK6质粒载体。6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述核酸分...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴法浩，李钢，高仰哲，
申请(专利权)人：南京红杉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32