一种利用多顺反子表达策略制备成熟L-谷氨酸氧化酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用多顺反子表达策略制备成熟L‑谷氨酸氧化酶的方法。利用多顺反子表达构建含有L－谷氨酸氧化酶α、β、γ链片段序列的重组表达载体pET‑Duet－(α+β+γ)，并转化至中E.coli BL21(DE3)并进行抗性筛选：挑取转化子并利用IPTG进行诱导表达，超声破碎细胞后，获得具有六聚体结构的成熟LGOX蛋白（α2β2γ2），本发明专利技术利用多顺反子表达策略快速获得成熟的LGOX蛋白，克服了传统利用商业化蛋白酶Sgmp进行酶解制备的产率低、成本高和工艺繁琐等缺点。

A Method for Preparing Mature L-Glutamate Oxidase Using Multi-cis-trans Expression Strategy

The invention discloses a method for preparing mature L glutamate oxidase by using multiple cistron expression strategy. The recombinant expression vector pET Duet-(alpha+beta+gamma) containing fragments of L-glutamate oxidase alpha, beta and gamma chains was constructed by multi-cis-trans expression and transformed into medium E.coli BL21(DE3) for resistance screening: transformants were selected and induced by IPTG, mature LGOX protein with hexamer structure (alpha 2 beta 2 gamma 2) was obtained after cell breakage by ultrasound. The sub-expression strategy can quickly obtain mature LGOX protein, which overcomes the shortcomings of traditional enzymatic hydrolysis with commercial protease Sgmp, such as low yield, high cost and cumbersome process.

【技术实现步骤摘要】
一种利用多顺反子表达策略制备成熟L-谷氨酸氧化酶的方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种成熟L－谷氨酸氧化酶的生产方法。
技术介绍
L－谷氨酸氧化酶(LGOX)可以催化L－谷氨酸氧化酶生成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢。α-酮戊二酸是一种重要的生物化合物。作为三羧酸循环的重要中间代谢产物之，α-酮戊二酸参与氨基酸、糖类、蛋白质以及脂肪代谢等重要生理过程，并且在微生物的碳氮代谢调控中起着重要作用。由α-酮戊二酸在细胞代谢上的重要性，其被广泛用于食品、医药、精细化工和化妆品行业，市场需求量巨大。此外，LGOX还被用于测定谷氨酸或制成测定谷氨酸的生物传感器，用于发酵和食品工业中的成分分析等。来源于Streptomycessp.X-19-6成熟的LGOX是一个含有六个亚基(α2β2γ2)的聚体蛋白，其中α亚基约为40kDa，β亚基约为16kDa，γ亚基约为12kDa。该LGOX在大肠杆菌中重组表达后仅能获得LGOX前体，需通过特殊处理后才可获得成熟酶。目前，主要采用来源于Streptomycesgriseus的商业化金属蛋白酶(Sgmp)，对LGOX前体进行酶切处理，产生α，β，γ链片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多顺反子表达L‑谷氨酸氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）通过PCR分别扩增得到α片段、β片段和γ片段；2）将α片段导入到pET‑DuetMCS1区域内，将γ片段和β片段通过重叠PCR得到γ+β片段后，导入到pET‑DuetMCS2区域内；构建得到含有L－谷氨酸氧化酶基因载体pET‑Duet－αβγ；3）将重组表达载体pET‑Duet－αβγ和pET‑Duet用限制性内切酶线性化后转入到E.coliBL21( DE3)感受态细胞中，通过抗性筛选并结合酶活测定，获得能够高效表达LGOX的重组菌pET‑Duet－αβγ；4）重组菌pET‑Duet－αβγ使用诱导剂诱导表达重组蛋白，超声...

【技术特征摘要】
1.多顺反子表达L-谷氨酸氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）通过PCR分别扩增得到α片段、β片段和γ片段；2）将α片段导入到pET-DuetMCS1区域内，将γ片段和β片段通过重叠PCR得到γ+β片段后，导入到pET-DuetMCS2区域内；构建得到含有L－谷氨酸氧化酶基因载体pET-Duet－αβγ；3）将重组表达载体pET-Duet－αβγ和pET-Duet用限制性内切酶线性化后转入到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，通过抗性筛选并结合酶活测定，获得能够高效表达LGOX的重组菌pET-Duet－αβγ；4）重组菌pET-Duet－αβγ使用诱导剂诱导表达重组蛋白，超声破碎细胞，离心，收集上清液，获得成熟LGOX。2.根据权利要求1所述的多顺反子表达L-谷氨酸氧化酶的方法，其特征在于，所述限制性内切酶为NcoⅠ、EcoRⅠ或者NdeⅠ、XhoⅠ。3.根据权利要求1所述的多顺反子表达L-谷氨酸氧化酶的方法，其特征在于，抗性筛选使用的抗生素为Amp。4.根据权利要求1所述的多顺反子表达L-谷氨酸氧化酶的方法，其特征在于，扩增α片段的引物为：Fα:CCATGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜岷，周杰，吕紫瑶，徐宁，周鑫海，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32