一种耐热性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种提高L‑氨基酸脱氨酶热稳定性的方法，是对奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L‑氨基酸脱氨酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为120位的Trp。本发明专利技术基于蛋白空间结构信息，对结构内部特殊氨基酸位点周围的空间环境及氨基酸之间包括氢键，离子键，范德瓦尔里等的相互作用进行分析，结合分子生物学技术对特定的氨基酸位点进行改造，通过理性设计突变位点，运用定点突变的方法获得L‑氨基酸脱氨酶突变体，可提高获得正向突变的酶突变体的概率，同时也大大减少了突变体筛选的工作量。本发明专利技术提高了酶的结构稳定性，进而有利于延长酶的使用寿命。

A Heat-resistant L-Amino Acid Deaminase Mutant and Its Preparation Method

The present invention belongs to the field of biotechnology, and relates to a method for improving the thermal stability of L_amino acid deaminase. It is an enzyme mutant obtained by site-directed mutagenesis of L_amino acid deaminase of Proteus mirabilis, in which the mutation site is 120 Trp. Based on the spatial structure information of proteins, the spatial environment around the special amino acid sites in the structure and the interaction between amino acids including hydrogen bond, ion bond, van der Waals, etc. are analyzed. The specific amino acid sites are modified by molecular biology technology. By rational design of mutation sites, the L_amino acid deaminase is obtained by site-directed mutation. Mutants can increase the probability of obtaining positive mutants of enzymes and greatly reduce the workload of mutant screening. The present invention improves the structural stability of the enzyme and is beneficial to prolonging the service life of the enzyme.

【技术实现步骤摘要】
一种耐热性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体及其制备方法
本专利技术属于生物
，涉及一种提高L-氨基酸脱氨酶热稳定性的方法。
技术介绍
L-氨基酸脱氨酶，存在于真菌、放线菌、细菌中，是一类FAD依赖型黄素酶，在有氧条件下，直接氧化L-氨基酸产生对应的酮酸和氨。在日用化学品、医药合成、食品加工等领域广泛使用。用L-氨基酸脱氨酶催化合成相应的酮酸，能够使氧化过程在相对温和的条件下高效地合成，避免高温、高压、强酸催化过程，同时还能在不使用或少使用诱导剂的情况下，实现高效的表达。整个过程高效，产品质量稳定。更为重要的是，酶法所生产的酮酸产品，不含有毒有害的强酸、重金属等成分，产生生物安全性好，可用于化妆品、医药等高附加值的领域。但目前L-氨基酸脱氨酶的酶比活较低，而且热稳定性比较差，酶使用周期短，影响其工业化运用。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是克服现有的L-氨基酸脱氨酶存在的上述酶比活较低、热稳定性差、酶使用周期短的缺陷，提供一种耐热性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体。本专利技术采用如下的技术方案：一种耐热性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体，是对奇异变形杆菌(Proteusmirabilis本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐热性提高的L‑氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，是对奇异变形杆菌L‑氨基酸脱氨酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为120位的Trp。

【技术特征摘要】
1.一种耐热性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，是对奇异变形杆菌L-氨基酸脱氨酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为120位的Trp。2.根据权利要求1所述的一种耐热性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，120位的Trp突变为Ala或Leu。3.根据权利要求1所述的一种耐热性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，突变体的DNA序列为SEQNO.2或SEQNO.3所示序列。4.如权利要求1所述的一种耐热性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体的制备方法，包括如下步骤：（1）全基因合成来源于奇异变形杆菌L-氨基酸脱氨酶（L-aminoaciddeaminase，LAAD）基因，NdeⅠ和HindⅢ连入pET24a，构建质粒LAAD，转化至E.ColiBL21(DE3)，构建重组菌PMLAAD；（2）以质粒LAAD为模板，利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游片段，然后将带有突变位点基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段；（3）将上述扩增产物经DNA纯化后，限制性内切酶DpnI对纯化的DNA片段酶切消化，纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴黎诚，郭小雷，章权，
申请(专利权)人：浙江正硕生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33