一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用，所述制备方法包括以下步骤：A.进行目的基因的扩增：以提取肺炎链球菌R6基因组为模板，采用引物P1和P2进行基因扩增；B.重组克隆菌株的构建：将扩增得到的二氢叶酸还原酶基因回收后连接到pEASYTM‑T1 Simple克隆质粒上，得到重组克隆载体，将重组克隆载体转化到感受态细胞；C.重组表达菌株的构建：将双酶切后获得的重组二氢叶酸还原酶基因连接到进行相同酶切处理的表达载体pET‑28a上，将重组表达载体pET‑28a‑dhfr转化到大肠杆菌中，筛选得到重组表达菌株；D.重组二氢叶酸还原酶的表达。上述制备方法简单，制备的重组表达菌株性状稳定，培养和表达周期短，能稳定表达高活性的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶。

Preparation and application of a recombinant dihydrofolate reductase from Streptococcus pneumoniae

The invention discloses a preparation method of recombinant Streptococcus pneumoniae dihydrofolate reductase and its application. The preparation method comprises the following steps: A. amplification of the target gene: gene amplification using primers P1 and P2 as template, and construction of recombinant cloning strain: amplification of the target gene; Recovered dihydrofolate reductase gene was linked to pEASYTM T1 Simple cloning plasmid, and the recombinant cloning vector was obtained. The recombinant cloning vector was transformed into competent cells. C. Construction of recombinant expression strain: The recombinant dihydrofolate reductase gene obtained after double digestion was connected to the expression vector after the same digestion. The recombinant expression vector pET 28a DHFR was transformed into Escherichia coli on body pET 28a, and the recombinant expression strain was screened and the expression of recombinant dihydrofolate reductase was detected. The preparation method is simple, the prepared recombinant expression strain has stable characteristics, short culture and expression cycle, and can stably express high activity of recombinant Streptococcus pneumoniae dihydrofolate reductase.

【技术实现步骤摘要】
一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用
本专利技术涉及基因工程和酶工程领域，尤其涉及一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用。
技术介绍
二氢叶酸是指生物的四氢叶酸生物合成的中间体，其本身不具辅酶活性，二氢叶酸还原酶为叶酸合成过程的催化酶，在辅助因子NADPH的存在下，催化二氢叶酸还原为具有辅酶活性的四氢叶酸。四氢叶酸是传递一碳单位的辅酶，是嘌呤或者嘧啶核苷酸合成所必须的辅酶。因此，二氢叶酸还原酶活性被抑制后，会直接影响生物体的核苷酸生物合成，目前二氢叶酸还原酶抑制剂被广泛用于杀虫、抑菌、治疗肿瘤等。因此，大量体外合成的二氢叶酸还原酶被需求用于进行二氢叶酸还原酶抑制剂的研究，具有很高的实验价值和医学价值。然而，传统化学合成酶的制备方法会导致制备的蛋白酶产品中残留有机溶剂和表面活性剂，制备的蛋白酶产品的生物活性低，不仅给制备高活性和高纯度的蛋白酶带来困难，而且难以达到实验和应用的要求。因此，现有的二氢叶酸还原酶的制备方法还有待进一步发展。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供了一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用，以解决传统化学合成酶制备方法得到的蛋白酶活性低，残留有机溶剂和表面活性剂的问题。一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：A.目的基因的扩增：提取肺炎链球菌R6基因组，以所述基因组为模板，采用引物P1和P2进行基因扩增，得到二氢叶酸还原酶基因，所述二氢叶酸还原酶基因的序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述引物P1的序列为SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述引物P2的序列为SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；B.重组克隆菌株的构建：将扩增得到的二氢叶酸还原酶基因回收后连接到pEASYTM-T1Simple克隆质粒上，得到重组克隆载体，将重组克隆载体转化到Trans1-T1感受态细胞中，筛选阳性重组克隆菌株，并进行鉴定；C.重组表达菌株的构建：将阳性重组克隆菌株过夜培养后进行质粒提取，将提取到的重组克隆质粒进行NdeI和XhoI双酶切，得到二氢叶酸还原酶基因，将二氢叶酸还原酶基因连接到进行相同酶切处理的表达载体Pet-28a上，得到重组表达载体pET-28a-dhfr，将重组表达载体pET-28a-dhfr转化到大肠杆菌BL(DE3)中，筛选后得到高效表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的重组表达菌株；D.重组二氢叶酸还原酶的诱导表达：将重组表达菌株进行培养，并向培养液中添加IPTG，诱导重组表达菌株表达重组二氢叶酸还原酶。所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，所述步骤A中，基因扩增的反应条件为：94℃预变性5min后，进行30个扩增反应循环，每个反应中条件为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；最后延伸7min。所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，所述步骤D具体包括以下步骤：挑取重组表达菌株至含有30μgmL-1的卡那霉素的培养液中，37℃，200rpm过夜培养后，将过夜培养的菌液用液体培养基稀释100倍后培养至OD值为0.5-0.8时，向培养液中加入0.5-1MIPTG，16-28℃条件下诱导5-16h，4℃条件下对培养液进行离心，收集菌体沉淀，用重悬缓冲液对菌体沉淀进行重悬后进行超声破碎，对悬液进行离心并收集上清液。所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，所述D步骤中，当所述OD值为0.6时，向培养液中加入0.5mMIPTG，16℃条件下诱导15h。所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，在步骤D之后，进行以下的步骤E的操作：E.重组二氢叶酸还原酶的纯化：对上清液进行镍离子亲和层析，先后采用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液对层析柱进行洗脱，得到纯化的重组二氢叶酸还原酶。所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，所述重悬缓冲液为由20mMTris-HCl、500mMNaCl、5-15mM咪唑组成的水溶液；所述洗涤缓冲液为由20mMTris-HCl，500mMNaCl，15-25mM咪唑组成的水溶液，洗脱缓冲液为由20mMTris-HCl，500mMNaCl，450-550mM咪唑组成的水溶液。所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其中，所述步骤E中，所述重悬缓冲液为由20mMTris-HCl、500mMNaCl、10mM咪唑组成的水溶液；所述洗涤缓冲液由20mMTris-HCl，500mMNaCl，20mM咪唑组成的水溶液，所述洗脱缓冲液为由20mMTris-HCl，500mMNaCl，500mM咪唑组成的水溶液。一种高效表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的重组表达菌株，其中，所述重组表达菌株采用如上所述的制备方法得到。如上所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶在磺胺增效剂类药物多残留检测方法中的应用。本专利技术提供的技术方案中，具有如下有益效果：1、本专利技术选用pEASYTM-T1Simple克隆质粒作为基因克隆载体，不仅连接效率高，并且操作简单，成功率高，还缩短了二氢叶酸还原酶基因的克隆阶段的时间。2、本专利技术选用pET-28a表达载体用于构建重组表达菌株，不仅保证重组表达菌株的基础表达水平低的前提下，最高程度的胞内表达二氢叶酸还原酶蛋白，并且表达出的二氢叶酸还原酶蛋白经过正确修饰和折叠，获得高活性的蛋白酶。3、本专利技术采用的重组表达菌株的表达最佳条件为：向培养液中加入0.5mMIPTG，16℃条件下诱导15h。上述条件下诱导表达的重组二氢叶酸还原酶不仅表达量高，并且保持高活性，应用价值高，为后期重组二氢叶酸还原酶的大规模生产奠定了基础。4、重组表达菌株表达出的重组二氢叶酸还原酶上携带上6×His-tag标记，本专利技术采用的镍离子亲和层析柱通过吸附重组二氢叶酸还原酶的6×His-tag标记，从而实现对重组二氢叶酸还原酶的特异结合，去除表达产物中的非目的蛋白，上述纯化方法操作简单、纯化特异性高，洗脱下来的重组二氢叶酸还原酶的活性不受影响；纯化过程中采用的洗涤缓冲液(20mMTris-HCl，500mMNaCl，15-25mM)和洗脱缓冲液(20mMTris-HCl，500mMNaCl，450-550mM咪唑)保证最大程度的洗脱去除表达产物中的非目的蛋白，随后能最大程度的洗脱下层析柱上吸附的重组二氢叶酸还原酶，提高重组二氢叶酸还原酶纯度和产量。5、本专利技术提供的制备方法简单，制备出的重组表达菌株性状稳定，繁殖和表达周期短，能稳定的高表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶。6、本专利技术提供的制备方法制得的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶，不仅产量高，并且纯度高，产物中不存在有机溶剂和表面活性剂，所述重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶活性高，对磺胺增效剂的识别敏感度高、结合能力强，可作为高效抗原应用于动物源食品中残留磺胺增效剂的多残留定量分析，分析灵敏度高，鉴定结果准确，适合于大规模生产和应用。附图说明图1为重组克隆菌株的PCR鉴定结果；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1-7为挑取的生长良好的单菌落。图2为重组克隆菌株的质粒酶切鉴定结果；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1-4为重组克隆质粒经过NdeI和XhoI双酶切后形成的片段。图3为重组表达菌株的PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：A.目的基因的扩增：提取肺炎链球菌R6基因组，以所述基因组为模板，采用引物P1和P2进行基因扩增，得到二氢叶酸还原酶基因，即目的基因，所述二氢叶酸还原酶基因的序列为SEQID NO:1所示的核苷酸序列，所述引物P1的序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述引物P2的序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；B.重组克隆菌株的构建：将扩增得到的二氢叶酸还原酶基因回收后连接到pEASYTM‑T1 Simple克隆质粒上，得到重组克隆载体，将重组克隆载体转化到Trans1‑T1感受态细胞中，筛选阳性重组克隆菌株，并进行鉴定；C.重组表达菌株的构建：将阳性重组克隆菌株过夜培养后进行质粒提取，将提取到的重组克隆质粒进行NdeI和XhoI双酶切，得到二氢叶酸还原酶基因，将二氢叶酸还原酶基因连接到进行相同酶切处理的表达载体pET‑28a上，得到重组表达载体pET‑28a‑dhfr，将重组表达载体pET‑28a‑dhfr转化到大肠杆菌BL(DE3)中，筛选后得到高效表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的重组表达菌株；D.重组二氢叶酸还原酶的诱导表达：将重组表达菌株进行培养，并向培养液中添加IPTG，诱导重组表达菌株表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶。...

【技术特征摘要】
1.一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：A.目的基因的扩增：提取肺炎链球菌R6基因组，以所述基因组为模板，采用引物P1和P2进行基因扩增，得到二氢叶酸还原酶基因，即目的基因，所述二氢叶酸还原酶基因的序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述引物P1的序列为SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述引物P2的序列为SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；B.重组克隆菌株的构建：将扩增得到的二氢叶酸还原酶基因回收后连接到pEASYTM-T1Simple克隆质粒上，得到重组克隆载体，将重组克隆载体转化到Trans1-T1感受态细胞中，筛选阳性重组克隆菌株，并进行鉴定；C.重组表达菌株的构建：将阳性重组克隆菌株过夜培养后进行质粒提取，将提取到的重组克隆质粒进行NdeI和XhoI双酶切，得到二氢叶酸还原酶基因，将二氢叶酸还原酶基因连接到进行相同酶切处理的表达载体pET-28a上，得到重组表达载体pET-28a-dhfr，将重组表达载体pET-28a-dhfr转化到大肠杆菌BL(DE3)中，筛选后得到高效表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的重组表达菌株；D.重组二氢叶酸还原酶的诱导表达：将重组表达菌株进行培养，并向培养液中添加IPTG，诱导重组表达菌株表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶。2.根据权利要求1所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，基因扩增的反应条件为：94℃预变性5min后；进行30个扩增反应循环，每个反应中条件为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；最后延伸7min。3.根据权利要求1所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述步骤D具体包括以下步骤：挑取重组表达菌株至含有30μgmL-1的卡那霉素的培养液中，37℃，200rpm过夜培养，将过夜培养的菌液用液体培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁晓，张启迪，于万鹏，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37