一种人血清中抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体-MMAE偶联物中和抗体检测方法技术

一种检测人血清中抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体‑MMAE偶联物中和抗体的方法，包括如下步骤：应用SK‑BR‑3细胞系作为靶细胞，研究药物生物活性；使用药物作为抗原免疫食蟹猴，使用药物F(ab)’2片段加强免疫，制备阳性多抗；应用SPE萃取技术对血清样本进行前处理，消除血清干扰，提高方法稳定性和药物耐受能力；基于药物活性方法开发中和抗体检测方法，应用于经处理后的血清样本中中和抗体的检测。本发明专利技术的方法源自基于细胞水平的生物活性方法，直接反映药物分子作用机理MoA；应用对药物作用更为敏感的SK‑BR‑3细胞，有利于方法灵敏度的提高；阳性对照抗体通过免疫非人灵长类制备，与真实样本的可比性更强；血清样本经前处理后再进行检测，检测结果更为稳定可靠。

Detection of anti-human epidermal growth factor receptor 2 monoclonal antibody-MMAE conjugate in human serum

A method for detecting monoclonal antibodies against human epidermal growth factor receptor 2 and MMAE conjugates and neutralizing antibodies in human serum includes the following steps: using SK BR 3 cell line as target cells to study drug biological activity; using drug as antigen to immunize crab-eating monkeys, using drug F(ab)'2 fragment to enhance immunity and prepare positive polyantibodies; using SPE extraction technology to carry out serum samples Pretreatment can eliminate serum interference, improve the stability and drug tolerance of the method. Neutralizing antibody detection method based on drug activity method was developed and applied to neutralizing antibody detection in the treated serum samples. The method of the present invention is derived from the biological activity method based on cell level, which directly reflects the mechanism of drug molecule action MoA; the application of SK BR 3 cells which are more sensitive to drug action is advantageous to the improvement of sensitivity of the method; the positive control antibody is prepared by immunizing non-human primates, and is more comparable with the real sample; the serum sample is pretreated and then detected, and the detection results are better. More stable and reliable.

【技术实现步骤摘要】
一种人血清中抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体-MMAE偶联物中和抗体检测方法
本专利技术涉及一种抗体药物偶联物中和抗体检测方法，具体是一种基于细胞水平分析方法检测人血清中抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体-MMAE偶联物中和抗体的方法。
技术介绍
抗体药物偶联物（ADC,Antibody-drugconjugate）是一种新型的治疗性蛋白药物，由三个部分组成，针对特定靶点的抗体，通过化学修饰的连接子（linker）与具有细胞毒性的小分子药物共价结合而形成。ADC通过其抗体分子结构区域与肿瘤细胞表面过表达的抗原靶点结合，达到特定部位，而经过特殊设计的连接体保证了其在到达特定位点之前的稳定性，从而特异性地释放小分子毒物。与抗原结合后，ADC刺激靶细胞发生内化作用而进入细胞。在胞内溶酶体作用下发生降解并释放小分子毒性药物。小分子药物在胞内与其特定靶点（如微管蛋白等）结合，通过抑制增殖、促进凋亡等发挥毒性作用杀死细胞。同时有些抗体存在抗肿瘤活性，如Kadcyla中曲妥珠单抗（trastuzumab）可与小分子药物DM1发挥协同作用。ADC通常用于肿瘤领域疾病的治疗，与传统的小分子化药相比，因具有靶向性强、毒副作用弱、半衰期长等优势，从而具有广阔的应用前景。作为一种蛋白药物复合物，ADC由于其分子结构的复杂性，给药物的免疫原性风险评估带来挑战。蛋白药物的免疫反应一般通过体液免疫途径介导，因此检测药物诱导产生的抗药抗体（Anti-drugantibody,ADA）成为免疫原性分析的重要指标。对于ADC药物而言，其免疫原性可能来自裸抗分子、linker、小分子药物以及偶联过程中产生的新位点（neo-epitope），而对确认为阳性的抗药抗体进行进一步的表位鉴定及中和抗体分析，可以帮助我们更好的理解并评价其免疫性质。蛋白药物的中和抗体（Neutralizingantibody，NAb）是指一类可以中和药物生物学活性的抗药抗体，直接影响药物的临床疗效。同时对于具有一定内源性的药物而言，中和抗体的产生也会带来严重的安全问题，因此中和抗体的分析也已成为法规的必然要求。据报道，Kadcyla大约有5%ADA阳性率，目前未出现中和抗体的报道。而分子结构中包含人鼠嵌和抗体的Adcetris，其ADA阳性率高达37%，且约有60%的ADA具有中和活性。本专利技术涉及一种抗人表皮生长因子受体2（HER2）单克隆抗体-MMAE（monomethylauristatinE）偶联物中和抗体的检测方法，现有文献未见直接报道。对于ADC而言，其中和抗体检测方法推荐采用基于细胞的活性方法（BonnieWu等，AAPSJournal,Vol.18,No.6,2016）。DebbieA.Murray等应用PromegaADCC受体生物活性试验开发了一种Herceptin中和抗体分析方法，ADCC（Antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity）效应与很多单抗药物的作用机理（MoA）紧密相关，然而并不能反映ADC药物作用机理中受体介导的细胞内吞及小分子释放产生的毒性作用。BT474细胞是一种高表达HER2的人乳房导管癌细胞，其增殖抑制试验常用于抗HER2药物的活性分析（GraziaArpino等，JNatlCancerInst2007,99）。G.Brockhoff等人发现，相对于另一种高表达HER2的人乳房腺癌细胞SK-BR-3细胞，BT474对于抗HER2抗体的治疗更为敏感（CellProlif.2007,40）。GailD.LewisPhillips等人比较了trastuzumab-DM1的细胞杀伤作用，发现SK-BR-3比BT474细胞对ADC的细胞毒性作用更为敏感（EC50分别为10~20ng/mL和100~200ng/mL），而BT474细胞毒性试验的效应窗口似乎更宽一些（CancerRes2008;68:22）。从kadcyla的药学审查资料（125427Orig1s000PharmR）中发现，研究者应用BT474细胞用于体外生物学活性的放行检测。然而如果基于该细胞开发中和抗体检测方法，考虑其对ADC药物的敏感性相对较低，选择EC50浓度作为药物的固定浓度时，相应地方法的灵敏度就会大打折扣。同时样品中血清及药物存在也会对检测结果的可信度带来挑战。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种灵敏可靠的人血清中抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体-MMAE偶联物中和抗体检测方法。本专利技术的方法应用SK-BR-3细胞，提高方法的灵敏度。且本方法应用了一种血清样品前处理方法，旨在消除基质干扰，同时提高方法的药物耐受能力，保证检测结果稳定可靠。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：本专利技术应用SK-BR-3细胞作为靶细胞，相比BT474细胞，其对抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体-MMAE偶联物更为敏感，进行中和抗体方法开发时，选择较低的EC50浓度作为药物的固定浓度，可以改善方法的灵敏度。同时本专利技术使用抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体-MMAE偶联物免疫食蟹猴制备阳性对照抗体，与真实样本产生的抗药抗体具有较强可比性。初次免疫后，使用药物分子F(ab)’2加强免疫，提高抗体中抗idiotype抗体的比例，从而提高阳性对照抗体的中和活性，同样有利于提高方法的灵敏度。采用固相萃取技术（SPE）定向萃取人血清中的ADA组分，可消除血清基质的干扰，同时提高方法的药物耐受能力，提高血药存在情况下检测结果的可信度。以下实例将对本专利技术进一步说明。本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂厂商所建议的条件。本实施例中涉及到的实验，操作过程如下：实施例1SK-BR-3细胞培养及增殖抑制实验根据需要使用适宜规格的培养瓶或培养皿培养SK-BR-3细胞（ATCC，HTB-30TM）。以75cm2培养瓶（Corning，430641）为例，该细胞传代过程如下：弃去培养基，使用无菌磷酸盐缓冲液（以下简称PBS）清洗瓶壁（含细胞层）一次。向瓶中加入1.5~2mL0.25%Trypsin-EDTA（Gibco，25200056）溶液，置于37°C，5%CO2培养箱中消化约3分钟。取出培养瓶，在倒置显微镜下观察细胞状态，当细胞边缘变为椭圆形并开始脱落时，轻拍瓶壁帮助细胞脱落，然后加入6~8mL完全培养基终止消化。完全培养基通过向RPMI-1640（Gibco，31800022）培养基中加入10%FBS（Gibco，10099141）混合而成。根据传代比例弃去多余细胞悬浮液，向剩余细胞悬浮液中补足完全培养基至约15mL。如需更换培养瓶，则按照传代比例吸取细胞悬浮液至新培养瓶中，向新瓶中补足完全培养基至约15mL。该细胞常用的传代比例为1：2~1：4，传代周期为每周2~3次。传代后细胞置于37°C，5%CO2培养箱中培养。该细胞增殖抑制实验过程如下：在倒置显微镜下观察，当单层细胞密度达到培养瓶约70%~80%时，按照上述方法进行消化。取约1mL细胞悬浮液，使用细胞活力分析仪进行计数。离心剩余细胞悬浮液，去除Trypsin本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测人血清中抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体‑MMAE偶联物中和抗体的方法，包括如下步骤：步骤一，应用SK‑BR‑3人乳腺癌细胞系作为靶细胞，研究药物增殖抑制活性，选择EC50左右浓度作为固定的药物浓度；步骤二，使用药物作为抗原免疫食蟹猴，使用药物分子F(ab)’2片段加强免疫，经药物亲和纯化制备多抗,用作阳性对照；步骤三，应用固相萃取技术从人血清中提取ADA，消除基质干扰，提高药物耐受能力。步骤四，人血清样本经步骤三处理后，检测抗药抗体中和活性。

【技术特征摘要】
1.一种检测人血清中抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体-MMAE偶联物中和抗体的方法，包括如下步骤：步骤一，应用SK-BR-3人乳腺癌细胞系作为靶细胞，研究药物增殖抑制活性，选择EC50左右浓度作为固定的药物浓度；步骤二，使用药物作为抗原免疫食蟹猴，使用药物分子F(ab)’2片段加强免疫，经药物亲和纯化制备多抗,用作阳性对照；步骤三，应用固相萃取技术从人血清中提取ADA，消除基质干扰，提高药物耐受能力。步骤四，人血清样本经步骤三处理后，检测抗药抗体中和活性。2.根据权利要求1所述的应用SK-BR-3作为靶细胞研究药物生物活性，其特征是，来源于人类乳腺癌细胞，细胞表面高表达HER2蛋白。其对药物作用非常敏感，细胞增殖抑制EC50在10ng/mL左右。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈秋宇，谭青乔，
申请(专利权)人：上海有临医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31