鸡白痢-J亚群禽白血病双重平板凝集抗原及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡白痢‑J亚群禽白血病双重平板凝集抗原及其制备方法，通过构建表面展示J亚群禽白血病特异性抗原GP85的质粒载体，并转入鸡白痢抗原制备菌株中，构建出可表面展示GP85的鸡白痢沙门氏菌，所述的鸡白痢沙门氏菌经IPTG可同时表达鸡白痢沙门氏菌表面抗原和J亚群禽白血病病毒特异性抗原，用于制备鸡白痢‑J亚群禽白血病双重平板凝集抗原，通过制备的双重抗原经一次反应同时检测两种疫病抗体，操作简易，特异性强，显著节约检测时间和检测成本，可用于栏圈边快速检测。

Dual Plate Agglutination Antigen of Avian Leukemia Subgroup J of Chicken Dysentery and Its Preparation Method

The invention discloses a double plate agglutinating antigen of chicken white diarrhea and subgroup J avian leukemia and its preparation method. By constructing a plasmid vector displaying the specific antigen GP85 of chicken white diarrhea on the surface and transferring it into the strain of chicken white diarrhea antigen preparation, a Salmonella pullorum displaying GP85 on the surface is constructed. The Salmonella pullorum can simultaneously express chicken white diarrhea Salmonella through IPTG. The bacterial surface antigen and the specific antigen of avian leukemia virus subgroup J were used to prepare the double plate agglutinating antigen of avian leukemia subgroup J of chicken dysentery. The double plate agglutinating antigen prepared by one reaction was used to detect the two kinds of epidemic antibodies simultaneously. The method was simple and specific, and could save the detection time and cost significantly. It could be used for the rapid detection at the edge of the fence.

【技术实现步骤摘要】
鸡白痢-J亚群禽白血病双重平板凝集抗原及其制备方法
本专利技术属于生物工程和检测
，具体涉及一种表面展示禽白血病特异性抗原GP85的鸡白痢沙门氏菌及其构建方法，改造后的鸡白痢沙门氏菌可以制备鸡白痢-J亚群禽白血病双重平板凝集抗原，用于同时检测鸡白痢沙门氏菌和禽白血病病毒感染抗体。
技术介绍
鸡白痢与禽白血病是两种严重危害我国养禽业的传染病。其中鸡白痢(PullorumDisease,PD)是由鸡白痢沙门氏菌(SP)引起的一类传染疾病，鸡白痢沙门氏菌可垂直传播和水平传播，对雏鸡危害很大，感染雏鸡表现为不吃饲料，怕冷，身体蜷缩，呼吸困难，精神沉郁或昏睡，排白色粘稠或淡黄、淡绿色稀便，肛门有时被硬结的粪块封闭，可引起较高的死亡率。禽白血病(AvianLeukosis)是由禽白血病病毒(ALV)引起的一种具有传染性的肿瘤性疾病，其中J亚群是我国主要流行的亚型，GP85蛋白是J亚群的群特异性蛋白。ALV能够引起鸡群患肿瘤性疾病，除了对鸡群造成直接危害外，还可导致鸡群免疫失败，继发感染，产蛋率降低等。由于鸡白痢和禽白血病均既可以垂直传播，也可以水平传播，给养鸡业造成严重的经济损失，难于根治。因此目前的防控策略以净化为主，通过淘汰抗体阳性的种鸡，在鸡场中净化鸡白痢和禽白血病，以达到防控的目的。高效的抗体检测方法与试剂对鸡白痢和禽白血病的净化具有关键的作用。目前针对鸡白痢感染主要采取全血或血清玻板凝集试验，通过采集鸡只全血或血清与鸡白痢凝集抗原反应，判断阳性或阴性；而针对禽白血病的检测主要包括病原分离鉴定、抗原/抗体ELISA检测等，耗时耗力，成本较高。由于鸡白痢和禽白血病均为种鸡场需要净化的病原，因此建立一种操作简单、可以同时检测鸡白痢和禽白血病的检测方法，将节约大量的人力、物力和财力。单独的GP85蛋白尽管可以与J亚群禽白血病抗体发生反应，但是由于颗粒小，无法实现肉眼可见的凝集。本专利技术在鸡白痢平板凝集检测技术的基础上，通过构建表面展示禽白血病特异性抗原GP85的质粒载体，并转入鸡白痢抗原制备菌株中，通过诱导实现GP85蛋白表面展示于鸡白痢沙门氏菌的细胞膜表面。运用表面展示GP85的鸡白痢沙门氏菌制备平板凝集抗原，即可与鸡白痢阳性抗体发生凝集反应，也可与禽白血病阳性抗体发生凝集反应，实现一次平板凝集试验同时检测鸡白痢和禽白血病，可用于栏圈边快速检测，为二者的净化提供方便高效的工具与技术手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种表面展示禽白血病特异性抗原GP85的鸡白痢沙门氏菌及其构建方法，通过构建表面展示J亚群禽白血病特异性抗原GP85的质粒载体，并转入鸡白痢抗原制备菌株中，构建出可表面展示GP85的鸡白痢沙门氏菌。通过将GP85蛋白表面展示于鸡白痢沙门氏菌的细胞膜表面，并制备平板凝集抗原，用于鸡白痢-J亚群禽白血病抗体检测，特异性强，操作简易。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种鸡白痢-J亚群禽白血病双重平板凝集抗原的制备方法，经过优化，实现GP85蛋白表面展示于鸡白痢沙门氏菌的细胞膜表面，并诱导改造后的鸡白痢沙门氏菌制备凝集抗原，产品凝集效果好。本专利技术还有一个目的是在于提供了一种鸡白痢-J亚群禽白血病双重平板凝集抗原在检测鸡白痢沙门氏菌感染和禽白血病感染抗体中的应用，与现有的鸡白痢平板凝集检测方法和禽白血病抗体ELISA检测方法相比，本专利技术一次反应同时检测两种疫病抗体阳性，操作简易，特异性强，将节约大量的人力、物力和财力。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术方案：表面展示禽白血病特异性抗原GP85的鸡白痢沙门氏菌，可同时表达鸡白痢表面抗原和J亚群禽白血病特异性抗原，构建方法如下：A：表面展示质粒的构建：运用分子克隆技术，经过酶切和连接，依次将lpp部分序列(编码信号肽，核苷酸序列如SEQIDNO.1)、ompA部分序列(编码外膜蛋白跨膜区，核苷酸序列如SEQIDNO.2)和gp85(编码禽白血病囊膜蛋白，核苷酸序列如SEQIDNO.3)连接至pQE80质粒，构建形成表面展示质pQE80-lpp-ompA-gp85；B：表面展示菌株的构建：制备鸡白痢沙门氏菌菌株的感受态细胞，加入重组质粒pQE80-lpp-ompA-gp85，经电转化后涂布带有氨苄抗性的LB平板培养，经过PCR鉴定获得可表面展示GP85的鸡白痢沙门氏菌。鸡白痢-J亚群禽白血病双重平板凝集抗原的制备方法如下：A：GP85的诱导表达：在表面展示禽白血病特异性抗原GP85的鸡白痢沙门氏菌培养液中加入IPTG，诱导禽白血病特异性抗原GP85表达；B：抗原制备：用福尔马林等方式灭活菌种，将灭活的菌液用含0.2％福尔马林的生理盐水重悬，加结晶紫溶液充分染色后无菌分装保存，即制得鸡白痢-J亚群禽白血病凝集抗原。鸡白痢-J亚群禽白血病双重平板凝集抗原在检测鸡白痢沙门氏菌感染和禽白血病感染抗体中的应用，其方法是：采集待检鸡群静脉血，分离待检血清与等体积的鸡白痢-J亚群禽白血病凝集抗原混合，搅拌均匀后摇动30秒，观察检测结果；阳性和阴性对照血清的处理方法与样品相同；发生凝集现象的血清判断为鸡白痢或J亚群禽白血病阳性，未发生凝集现象的为阴性。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：1、鸡白痢和禽白血病是国家要求实现种禽场净化的两种禽类重要疫病，其中一种疫病为阳性，即应淘汰鸡只。现有方法是分别检测这两种疫病，其中鸡白痢感染的现场初筛是通过平板凝集试验，而禽白血病的抗体检测是通过ELISA方法，依赖实验室操作和相关设备，实验室检测时间约为1小时，成本为10到12元/份。本专利技术的优点之一是将两种病原抗体检测结合在一起，通过一次反应检测两种疫病的抗体，阳性鸡只淘汰，检测时间约为5到10分钟，检测成本0.5元/份，显著节约了检测时间和检测成本，且不依赖于实验室，可用于栏圈边快速检测。2、现有方法要实现单个蛋白的凝集反应检测，需要通过乳胶颗粒偶联蛋白，将蛋白附着在大的乳胶颗粒上，使得偶联蛋白的乳胶颗粒与抗体反应后出现肉眼可见的凝集。本专利技术以鸡白痢沙门氏菌为载体，将J亚群白血病特异性抗原GP85表面展示于鸡白痢沙门氏菌表面，使得GP85以鸡白痢沙门氏菌为载体，辅以结晶紫染色，达到肉眼可见的凝集反应。附图说明图1为表面展示质粒pQE80-lpp-ompA-gp85的构建示意图，依次通过酶切连接，将lpp、ompA和gp85连接至pQE80质粒，构建出pQE80-lpp-ompA-gp85。图2为重组表面展示质粒pQE80-lpp-ompA-gp85的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中左侧为用限制性内切酶BamHⅠ,SacⅠ，SalⅠ和HindⅢ酶切的图谱，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见酶切产物分别有大小为99bp、342bp、924bp的特异性条带，右侧为DNAMarker。图3为gp85在SPTC07/pQE80-lpp-ompA-gp85细菌中的蛋白表达SDS-PAGE图。Marker：预染蛋白Marker，1：SPTC07/pQE80-lpp-ompA诱导后，2：SPTC07/pQE80-lpp-ompA未诱导，3：SPTC07/pQE80-lpp-ompA-gp85诱导后，4：SPTC07/pQE80-lpp-ompA-gp85未诱导。图4为GP85本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.表面展示J亚群禽白血病特异性抗原GP85的鸡白痢沙门氏菌，其特征在于，将构建的表面展示质粒pQE80‑lpp‑ompA‑gp85转化鸡白痢沙门氏菌，得到表面展示禽白血病特异性抗原GP85的鸡白痢沙门氏菌，同时表达鸡白痢沙门氏菌表面抗原和J亚群禽白血病病毒特异性抗原。

【技术特征摘要】
1.表面展示J亚群禽白血病特异性抗原GP85的鸡白痢沙门氏菌，其特征在于，将构建的表面展示质粒pQE80-lpp-ompA-gp85转化鸡白痢沙门氏菌，得到表面展示禽白血病特异性抗原GP85的鸡白痢沙门氏菌，同时表达鸡白痢沙门氏菌表面抗原和J亚群禽白血病病毒特异性抗原。2.根据权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌，其特征在于，所述表面展示质粒中基因lpp的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，基因ompA的核苷酸序列如SEQIDNO....

【专利技术属性】
技术研发人员：张腾飞，王红琳，汪宏才，罗青平，邵华斌，张文婷，温国元，张蓉蓉，罗玲，卢琴，商雨，郭晓东，程伊洛，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42