本发明专利技术提供一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用，所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌E.coli MG1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因敲出，并导入核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示四氢嘧啶合成基因簇ectABC获得的。所述二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术诱导表达后的菌体以L‑天冬氨酸钠为底物，生物转化制备四氢嘧啶。转化20‑30h后，四氢嘧啶产量达到2.5‑3.5g/L，具有较好的工业应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用(一)
本专利技术涉及一种重组大肠杆菌全细胞转化合成四氢嘧啶的方法，属于基因工程和生物
(二)
技术介绍
海洋微生物为了适应深海的高盐条件，需要依赖于一种被称为相容性溶质机制的策略(Compatible-Solutes，Strategy)，来抗衡外界盐环境形成的负面影响，维持渗透压平衡。根据化学结构，相容性溶质主要包括：①糖类及衍生物：蔗糖、海藻糖、甘油葡萄苷等；②多元醇类及衍生物：甘油山梨醇、甘露醇等；③氨基酸及衍生物：脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、四氢嘧啶、5-羟基四氢嘧啶等；④甜菜碱类：甜菜碱、甘氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱。相容性溶质作为细胞的渗透压保护剂，有很好的稳定生物大分子的功能，对细胞内的蛋白酶和其它大分子物质起着抗热、抗冻和抗变性等稳定作用。四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，Ectoine)，是目前发现分布最广泛的相容性溶质，它与细胞相容性好，高浓度的积累可对抗渗透压冲击，且不干扰细胞的新陈代谢和蛋白质的正确折叠，甚至具有稳定蛋白质结构的作用，被广泛的运用：①被称为“分子伴侣”保护生物大分子；②蛋白质与酶分子稳定剂；③DNA结构稳定和保护剂；④生物医药，如阿尔兹海默氏症、帕金森病、结肠炎等疾病的治疗过程均有一定的作用，并且最新研究发现四氢嘧啶能够提高皮肤的再生能力、延缓其老化和抑制黑色素的生成，可作为安全的化妆品保湿剂与增白剂。⑤据报道，高纯度的四氢嘧啶市场价约$1300/kg。其结构式如下：由于四氢嘧啶的手性结构和最初可分离到的菌株四氢嘧啶产量极低，而且化学合成成本很高，很难直接应用于商业用途，导致四氢嘧啶的相关研究进展难以推进。目前，以天冬氨酸钠为底物，采用重组大肠杆菌进行全细胞生物催化生成四氢嘧啶，已广泛应用于四氢嘧啶的大规模生产。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种产生四氢嘧啶的工程菌、构建方法及制备四氢嘧啶的方法，为后续工业化生产四氢嘧啶奠定基础。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种产生四氢嘧啶的重组大肠杆菌(E.coliHect)，所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌E.coliMG1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因敲出，并导入核苷酸序列为SEQIDNO.1所示四氢嘧啶合成基因簇ectABC获得的。所述二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC先与pTrc99a质粒连接，再将重组质粒导入宿主菌获得的。本专利技术所述产生四氢嘧啶的重组大肠杆菌(E.coliHect)的构建方法如下：(1)敲出大肠杆菌E.coliMG1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因，切断L-天冬氨酸到赖氨酸支路的代谢，获得大肠杆菌E.coliMG1655-1。(2)从伸长盐单胞菌H.elongata(CGMCC1.6329)中克隆四氢嘧啶的合成基因簇ectABC，以pTrc99a质粒为载体导入到大肠杆菌E.coliMG1655-1，构建从L-天冬氨酸到四氢嘧啶的合成途径，基因簇ectABC分别表达氨基丁酸乙酰基转移酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶，构建得到产生四氢嘧啶的工程菌E.coliHect。本专利技术还提供一种重组大肠杆菌在转化合成四氢嘧啶中的应用，所述的应用为：以重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂加入转化液中，在25-45℃、150-200rpm条件下进行转化反应6-48h(优选40℃，200rpm反应24h)，反应结束，获得含四氢嘧啶；所述转化液终浓度组成：L-天冬氨酸钠5-80g/L，甘油5-80g/L，氯化钾0-50g/L，溶剂为PBS缓冲溶液，pH6.5-8.0，优选转化液终浓度组成：L-天冬氨酸钠5-20g/L，甘油5-25g/L，氯化钾10-50g/L，溶剂为PBS缓冲溶液，pH6.0-8.0。进一步，所述湿菌体用量以转化液体积计为4-7g/L，优选6g/L。进一步，湿菌体发酵方法为：将重组大肠杆菌接种至发酵培养基，在28-37℃、150-200rpm(优选37℃，200rpm)条件下震荡培养至OD600为0.6-0.8，再加入终浓度50mg/mL的IPTG进行诱导，在28-37℃、150-200rpm条件下震荡培养8-12h(优选30℃，200rpm震荡培养12h)，获得发酵液，将发酵液离心(4000-7000rpm离心5min，优选5000rpm，4℃离心5min)，获得湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成：酵母提取物5-20g/L，胰蛋白胨5-15g/L，氯化钠10-50g/L，溶剂为去离子水，pH7.0-7.3；优选发酵培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。本专利技术所述湿菌体在发酵前先进行种子培养，再将种子液以体积浓度5-10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养方法为：将重组大肠杆菌接种于种子培养基，在28-37℃、150-200rpm条件下震荡培养至对数生长期，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成：酵母提取物5-20g/L，胰蛋白胨5-15g/L，氯化钠10-50g/L，溶剂为去离子水，pH7.0-7.3。优选种子培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。进一步，优选所述转化液终浓度组成：L-天冬氨酸钠10g/L，甘油10g/L，氯化钾10g/L，溶剂为PBS缓冲溶液，pH6.5。本专利技术所述重组大肠杆菌(Escherichiacoli)Hect，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNO.60398，保藏日期2018年6月28日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编：510075。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：(1)在E.coliMG1655中异源表达H.elongata的四氢嘧啶生物合成基因簇ectABC，并通过系统代谢改造切断赖氨酸合成途径，四氢嘧啶的产率提高了134％，得到产四氢嘧啶的工程菌E.coliHect。(2)传统发酵生产四氢嘧啶的菌株，需要依赖高盐的刺激诱导，对设备损耗严重，本专利技术以L-天冬氨酸钠为底物，全细胞生物催化产生四氢嘧啶，成功实现不依赖高盐的诱导。(四)附图说明图1为SDS-PAGE分析四氢嘧啶基因簇ectABC在工程菌E.coliHect的表达情况；M，蛋白质Marker；1:E.coliMG1655-1-pTrc99a；2:E.coliHect；图2为HPLC检测四氢嘧啶谱图；a:四氢嘧啶标准品；b:E.coliHectABC转化液；图3为不同转化液组成及反应条件对四氢嘧啶制备的影响，A为L-天冬氨酸钠，B为氯化钾，C为甘油，D为反应温度，E为pH值，F为反应时间。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：大肠杆菌四氢嘧啶代谢通路的构建1.lysA基因的敲出利用Red同源重组基因操作方法根据E.coliMG1655的lysA基因序列和pKD3质粒序列，设计引物lysA-1和lysA-2，以pKD3为模板扩增抗性片段。PCR扩增的程序：30个循环，98℃变性30sec，55℃退火15本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌E.coli MG1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因敲出，并导入核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示四氢嘧啶合成基因簇ectABC获得的。
【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌E.coliMG1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因敲出，并导入核苷酸序列为SEQIDNO.1所示四氢嘧啶合成基因簇ectABC获得的。2.如权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC先与pTrc99a质粒连接，再将重组质粒导入宿主菌获得的。3.一种权利要求1重组大肠杆菌在转化合成四氢嘧啶中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：以重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂加入转化液中，在25-45℃、150-200rpm条件下进行转化反应6-48h，反应结束，获得四氢嘧啶；所述转化液终浓度组成：L-天冬氨酸钠5-80g/L，甘油5-80g/L，氯化钾0-50g/L，溶剂为PBS缓冲溶液，pH6.0-8.0。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体用量以转化液体积计为4-7g/L。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于湿菌体发酵方法为：将重组大肠杆菌接种至发酵培养基，在28-37℃、150-200rpm条件下震荡培养至OD600为0.6-0.8，再加入终浓度50mg/mL的IPTG进行诱导，在28-37℃、150-200rpm条件下震荡培养8-12h，获得发酵液，将发酵液离...
【专利技术属性】
技术研发人员：王鸿，陈俊，储消和，柳鹏福，陈建伟，章华伟，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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