一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种2‑甲基柠檬酸高产基因工程菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术的2‑甲基柠檬酸高产基因工程菌是由苏云金芽胞杆菌BMB171基因组中敲除2‑甲基柠檬酸脱水酶基因prpD而得到的。本发明专利技术还提供了上述2‑甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，以苏云金芽胞杆菌BMB171为出发菌株，利用基于归巢内切酶I‑SceI诱发染色体同源重组机制的基因敲除体系成功获得2‑甲基柠檬酸脱水酶(PrpD)基因无痕缺失突变株ΔprpD。通过液相色谱和质谱的检测发现，与出发菌株BMB171相比，ΔprpD菌株胞内2‑甲基柠檬酸浓度提高了217倍，且与化学法合成的2‑甲基柠檬酸相比，本发明专利技术法所产生的2‑甲基柠檬酸空间构型专一。

A 2-Methyl Citric Acid Producing Genetically Engineered Bacteria and Its Construction Method

The invention relates to a 2 -methyl citric acid high-yield genetic engineering bacteria and a construction method thereof, belonging to the field of genetic engineering technology. The 2 methyl citrate high-yield genetic engineering bacteria of the present invention is obtained by knocking out the 2 methyl citrate dehydratase gene prpD in the genome of Bacillus thuringiensis BMB171. The present invention also provides the construction method of the above 2 methyl citrate high-yield genetic engineering bacteria. Taking Bacillus thuringiensis BMB171 as the starting strain, the 2 methyl citrate dehydratase (PrpD) gene deletion mutant prpD was successfully obtained by using the gene knockout system based on homing endonuclease I SceI induced homologous recombination mechanism. Compared with the original strain BMB171, the intracellular concentration of 2 -methyl citric acid of prpD strain increased 217 times, and the spatial configuration of 2 -methyl citric acid produced by the method is specific compared with the 2 methyl citric acid synthesized by chemical method.

【技术实现步骤摘要】
一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌及其构建方法
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌及其构建方法。
技术介绍
苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一类杆状、产芽胞的革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤、植物叶表、植物根际等环境中，也是重要的昆虫病原菌。Bt最显著的特点是在形成芽胞的过程中产生由杀虫晶体蛋白组成的伴胞晶体，因而被广泛地用作微生物杀虫剂，具有杀虫活性高、杀虫谱广、对人畜安全、环境友好等优点。同时，Bt因培养周期短、中心代谢旺盛，是构建各种工程菌株的理想宿主。而苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171拥有遗传背景清晰、转化效率高、质粒兼容性及稳定性强等诸多优势，在蛋白质异源表达、高产小分子代谢物等方面极具潜力。2-甲基柠檬酸是2-甲基柠檬酸循环的中间代谢物。2-甲基柠檬酸的合成是在2-甲基柠檬酸合成酶PrpC的催化下，以丙酰-CoA和草酰乙酸为底物缩合而成；其降解则是在2-甲基柠檬酸脱水酶PrpD的作用下脱水形成2-甲基顺乌头酸。大量实验表明，细菌胞内2-甲基柠檬酸的积累能够产生细胞毒性，抑制细菌生长。例如，在肠道沙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种2‑甲基柠檬酸高产基因工程菌，其特征在于，是由苏云金芽胞杆菌BMB171基因组中敲除2‑甲基柠檬酸脱水酶基因prpD而得到的。

【技术特征摘要】
1.一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌，其特征在于，是由苏云金芽胞杆菌BMB171基因组中敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD而得到的。2.根据权利要求1所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌，其特征在于，所述2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。3.一种如权利要求1-2任一项所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选择含有壮观霉素抗性基因、归巢内切酶I-SceI特异识别作用位点、多克隆位点MCS、能在苏云金芽胞杆菌BMB171中复制的温敏型初始质粒，获取将要敲除的prpD基因上下游同源片段依次克隆到初始质粒中获得敲除载体；(2)将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌BMB171中，筛选获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的单交换菌株；(3)将含有卡那霉素抗性基因、能够编码I-SceI酶的诱导质粒导入所述单交换菌株，在选择平板上选择获得第二次同源重组并实现靶基因prpD敲除的苏云金芽胞杆菌BMB171突变菌株；(4)挑取经PCR验证的靶基因prpD敲除的苏云金芽胞杆菌BMB171突变菌株在无选择压力的条件下转接3～5次连续传代培养，获得质粒丢失的靶基因prpD敲除的苏云金芽胞杆菌BMB171突变菌株，即为2-甲基柠檬酸高产基因工程菌。4.根据权利要求3所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤为：通过PCR技术，以出发菌株苏云金芽胞杆菌BMB171的总DNA为模板，分别扩增prpD靶基因上游和下游长度为0.7～1kb的同源序列片段，将他们依次连接到初始质粒上获得敲除载体。5.根据权利要求4所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述初始质...

【专利技术属性】
技术研发人员：都萃颖，郑操，张中强，李国元，戴余军，
申请(专利权)人：湖北工程学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42