产生生物表面活性剂的重组微生物制造技术

本发明专利技术提供一种提高MEL的生产效率的方法。本发明专利技术是一种具有编码脂肪酶的外源性核酸、且具有产生甘露糖赤藓糖醇脂的能力的重组微生物。

Recombinant microorganisms producing biosurfactants

The invention provides a method for improving the production efficiency of MEL. The present invention is a recombinant microorganism with exogenous nucleic acid encoding lipase and the ability to produce mannose erythritol lipid.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生生物表面活性剂的重组微生物
本专利技术公开一种涉及使用了微生物的生物表面活性剂的制造的技术。
技术介绍
脂肪酶是切断构成植物油脂等油脂类的甘油三酯的酯键、分解为脂肪酸和甘油的酶。很多生物拥有脂肪酶，脂肪酶不仅用于生物体内的反应，而且用于很多工业用途。生物表面活性剂是微生物所生产的天然的表面活性剂，生物降解性高，环境负担低，具有各种有益的生理功能。因此，如果在食品工业、化妆品工业、医药品工业、化学工业、环境领域等中使用生物表面活性剂，则在实现环境和谐型的社会方面有意义。生物表面活性剂被分类为糖脂系、乙酰肽系、磷脂系、脂肪酸系及高分子系5种。它们当中，糖脂系的表面活性剂得到最多的研究。作为此种糖脂系的生物表面活性剂，已知有在将赤藓醇与甘露糖进行糖苷键合而得的甘露糖赤藓糖醇(以下也称作ME。)上再酯键合脂肪酸而得的甘露糖赤藓糖醇脂(以下也称作MEL。)、以及鼠李糖脂、黑粉菌酸(ユスチラジン酸)、海藻糖脂、以及槐糖脂等。关于MEL，报告过很多以植物油脂等油脂类为原料制造的例子。例如，非专利文献1及2中，报告过能够使用假丝酵母属(Candidasp.)B-7株由5质量％的大豆油在5天中生产35g/L(生产速度：0.3g/L/h、原料收率：70质量％)的MEL。非专利文献3及4中，报告过能够使用南极假丝酵母(Candidaantarctica)T-34株由8质量％的大豆油在8天中生产38g/L(生产速度：0.2g/L/h、原料收率：48质量％)的MEL。非专利文献5中，报告过能够使用南极假丝酵母T-34株利用以6天间隔共计3次的逐次流加在24天后由25质量％的花生油生产110g/L(生产速度：0.2g/L/h、原料收率：44质量％)的MEL。非专利文献6中，报告过能够使用假丝酵母(Candidasp.)SY-16株由10质量％的植物油脂利用间歇培养法在200小时中生产50g/L(生产速度：0.25g/L/h、原料收率：50质量％)的MEL，并且能够利用流加培养法由20质量％的植物油在200小时中生产120g/L(生产速度：0.6g/L/h、原料收率：50质量％)的MEL。MEL中存在有键合的脂肪酸残基以及乙酰基的位置及个数等彼此不同的各种结构。图1中，表示出将氢原子、乙酰基、以及碳原子数3～18的脂肪酸残基以R1～R5表示的MEL的结构式。R1及R2为脂肪酸残基且R3及R4为乙酰基的结构物被定义为MEL－A，R3为氢原子且R4为乙酰基的结构物被定义为MEL－B，R3为乙酰基且R4为氢原子的结构物被定义为MEL－C，R3及R4为氢原子的结构物被定义为MEL－D。根据与甘露糖键合的赤藓醇的羟甲基是来自于1位的碳、还是来自于4位的碳，所得的ME的结构如图2(a)、(b)所示彼此不同。所述南极假丝酵母T-34株生成以图2(a)所示的4－O－β－D－吡喃甘露糖基(mannopyranosyl)－赤藓糖醇(erythritol)作为糖骨架的化合物。也将所得的4－O－β－D－吡喃甘露糖基－赤藓糖醇脂(erythritolLipid)称作4－O－β－MEL。很多种类的微生物生成上述的4－O－β－MEL，然而筑波类酵母(Pseudozymatsukubaensis)以橄榄油为原料，生成以图2(b)所示的1－O－β－D－吡喃甘露糖基－赤藓糖醇作为糖骨架的1－O－β－D－吡喃甘露糖基－赤藓糖醇脂－B(以下也称作1－O－β－MEL－B。)。1－O－β－MEL－B具有与4－O－β－MEL－B相比水合性提高、泡囊(ベシクル)形成能力也高的特征，是有望用作护肤剂等的生物材料。报告过Pseudozymatsukubaensis1E5株能够由20质量％的橄榄油在7天中生产70g/L(生产速度：0.4g/L/h、原料收率：35质量％)的1－O－β－MEL－B(参照非专利文献7)，被作为化妆品材料销售。现有技术文献非专利文献非专利文献1：T.Nakahara，H.Kawasaki，T.Sugisawa，Y.TakamoriandT.Tabuchi：J.Ferment.Technol.，61，19(1983)非专利文献2：H.Kawasaki，T.Nakahara，M.OogakiandT.Tabuchi：J.Ferment.Technol.，61，143(1983)非专利文献3：D.Kitamoto，S.Akiba，C.HiokiandT.Tabuchi：Agric.Biol.Chem.，54，31(1990).非专利文献4：D.Kitamoto，K.Haneishi，T.NakaharaandT.Tabuchi：Agric.Biol.Chem.，54，37(1990).非专利文献5：D.Kitamoto，K.Fijishiro，H.Yanagishita，T.NakaneandT.Nakahara：Biotechnol.Lett.，14，305(1992).非专利文献6：金，伊炳大，桂树彻，谷吉树：平成10年日本生物工学会大会要旨，p195.非专利文献7：T.Morita，M.Takashima，T.Fukuoka，M.Konishi，T.Imura，D.Kitamoto：Appl.Microbiol.Biotechnol.，88，679(2010)
技术实现思路
专利技术所要解决的问题为了在食品工业、医药品工业、以及化学工业等中广泛地普及MEL，希望提高MEL的生产效率，实现生产成本的降低。因而，以提供提高此种MEL的生产效率的方法作为一个课题。用于解决问题的方法为了解决该问题反复进行了深入研究，结果发现，通过使具有生产生物表面活性剂的能力的微生物表达外源性的脂肪酶，由此，基于该微生物的生物表面活性剂的生产效率飞跃性地提高。另外发现，通过在包含脂肪酸及甘油的培养基中培养具有生产生物表面活性剂的能力的微生物，由此，基于该微生物的生物表面活性剂的产生效率飞跃性地提高。基于这些见解，反复进行了进一步的研究和探讨，结果提供以下述为代表的专利技术。第一项一种重组微生物，其具有编码脂肪酶的外源性核酸、且具有产生甘露糖赤藓糖醇脂的能力。第二项根据第一项中记载的重组微生物，其中，上述微生物是属于类酵母(Pseudozyma)属的微生物。第三项根据第一项或第二项中记载的重组微生物，其中，上述微生物是属于Pseudozymatsukubaensis的微生物。第四项根据第一项～第三项中任一项记载的重组微生物，其中，脂肪酶与选自序列号1～9、24、以及25中的氨基酸序列具有90％以上的相同性。第五项一种方法，该方法使用第一项～第三项中任一项记载的重组微生物制造甘露糖赤藓糖醇脂。第六项一种制造第四项中记载的甘露糖赤藓糖醇脂的方法，该方法包括在包含植物油脂的培养基中培养上述微生物。第七项一种制造甘露糖赤藓糖醇脂的方法，该方法包括在添加有脂肪酸及甘油的培养基中培养具有产生甘露糖赤藓糖醇脂的能力的微生物。专利技术效果能够高效地制造生物表面活性剂。附图说明图1表示MEL的结构。图2表示4－O－β－D－吡喃甘露糖基－赤藓糖醇(a)及1－O－β－D－吡喃甘露糖基－赤藓糖醇(b)的结构。图3表示通过将纯化脂肪酶添加到培养基中而评价对MEL生产效率的影响的结果。图4表示表达载体pUC＿ne本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组微生物，其具有编码脂肪酶的外源性核酸、且具有产生甘露糖赤藓糖醇脂的能力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.03 JP 2016-1120871.一种重组微生物，其具有编码脂肪酶的外源性核酸、且具有产生甘露糖赤藓糖醇脂的能力。2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，所述微生物是属于类酵母Pseudozyma属的微生物。3.根据权利要求1或2所述的重组微生物，其中，所述微生物是属于筑波类酵母Pseudozymatsukubaensis的微生物。4.根据权利要求1～3...

【专利技术属性】
技术研发人员：森田友岳，杂贺梓，小池英明，福冈德马，北本大，山本周平，岸本高英，
申请(专利权)人：国立研究开发法人产业技术综合研究所，东洋纺株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP