一种多环芳烃降解工程菌及其工程改造方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种多环芳烃降解工程菌及其工程改造方法和应用。从铜绿假单胞菌SA1克隆得到编码环裂解双加氧酶的降解基因——catA2基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；特异性oprL启动子核苷酸序列如SEQ ID No.2；选择广宿主质粒pBBR1MCS‑5为载体；catA2基因和oprL启动子分别克隆至pBBR1MCS‑5载体中，转入受体细胞中克隆扩增，筛选阳性克隆得到目标重组载体pBBR1MCS‑5‑oprL‑catA2；利用铜绿假单胞菌SA1作为宿主，将重组载体pBBR1MCS‑5‑oprL‑catA2通过电击法转化入铜绿假单胞菌种，构建工程铜绿假单胞菌。具有对多环芳烃的降解能力。

【技术实现步骤摘要】
一种多环芳烃降解工程菌及其工程改造方法和应用
本专利技术涉及一种多环芳烃降解工程菌及其工程改造方法和应用，属于生物降解领域和基因工程领域。
技术介绍
多环芳烃是指分子中含有2个或2个以上苯环的碳氢化合物，如萘、蒽、菲、芘、联苯、三联苯等。多环芳烃广泛存在于土壤、水体和空气中，水溶性差、具有热稳定性，而且其中相当的一部分都具有慢性毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”作用，对人类健康和生态环境造成了巨大危害，是环境中一类危险而需重点研究的化合物。多环芳烃在环境中的归宿包括挥发、光氧化、化学氧化、生物积累、土壤吸附及微生物降解等，研究表明，微生物降解在该污染物的迁移转化乃至最终从环境中消失的过程中占有重要的地位，是环境中多环芳烃去除最主要的途径。随着多环芳烃带来的环境污染问题日益突出，相关研究不断深入，研究的重点已经从一般寻找降解污染物的微生物转入以基因工程技术为基础构建高效降解多环芳烃的基因工程菌株。假单胞菌拥有极为复杂的酶系统，具有降解利用多种复杂有机物的潜力，假单胞菌的菌株几乎可以降解现有的任何复杂有机物，降解这类物质的基因多数是在质粒上的，通常的过程是由质粒编码的酶，通过脱氢、加氧、水解、脱羧等作用，将复杂的有机物降解为相对简单的物质，最终转变为短链的脂肪酸进入三羧酸循环，产生能量、二氧化碳和水。但是多环芳烃污染物降解存在两个限速步骤，初步开环和最后一步环裂解，所以在野生菌中通常这一降解过程进行缓慢，难以满足环境保护的需要。为改善假单胞菌降解多环芳烃的能力，可以通过强化该菌限速步骤的酶，来实现较高的降解能力。但假单胞菌的转化较困难，利用热激转化率较低，为获得高的转化效率更多的研究者倾向于使用接合或者电击转化的方法将质粒引入受体菌。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种多环芳烃降解工程菌及其工程改造方法和应用，使得菌株可以对多环芳烃污染物进行更高效率地降解。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种多环芳烃降解工程菌，其特征是pBBR1MCS-5-oprL-catA2表达载体通过在广宿主质粒插入编码环裂解双加氧酶的降解基因和相关启动子oprL基因构建得到，再将表达载体导入受体菌株铜绿假单胞菌SA1得到一种多环芳烃降解工程菌——工程铜绿假单胞菌PH2。所述的铜绿假单胞菌SA1筛选自石油污染土壤，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年2月18日，保藏编号CGMCCNo.12142，保藏名称铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。所述的多环芳烃编码基因的序列，设计特异性引物：catAF：5’-ATGACCGTGAAGATATCTCACAC-3’，catAR：5’-TTAGATTTCTTGCAAGGCTCTCG-3’。本专利技术的多环芳烃降解工程菌的构建方法，包括以下步骤：(1)从铜绿假单胞菌SA1中克隆得到编码环裂解双加氧酶的降解基因——catA2基因，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；特异性oprL启动子核苷酸序列如SEQIDNo.2；选择广宿主质粒pBBR1MCS-5为载体；catA2基因和oprL启动子分别克隆至pBBR1MCS-5载体中，转入受体细胞中克隆扩增，筛选阳性克隆得到目标重组载体pBBR1MCS-5-oprL-catA2；(2)利用铜绿假单胞菌SA1作为宿主，将重组载体pBBR1MCS-5-oprL-catA2通过电击法转化入铜绿假单胞菌种，构建得到多环芳烃降解工程菌——工程铜绿假单胞菌PH2。本专利技术的多环芳烃降解工程菌在多环芳烃污染物降解中的应用。具体说明如下：本专利技术提供了一种多环芳烃降解工程菌，该工程菌株包括铜绿假单胞菌SA1、转入假单胞菌的表达载体、相关启动子和参与多环芳烃降解过程的关键基因。作为优选，多环芳烃降解的关键基因为编码多环芳烃环裂解双加氧酶的基因。pBBR1MCS-5质粒购买自淼灵生物科技有限公司。本专利技术还提供了所述基因工程菌在多环芳烃污染物降解中的应用，所述应用方法：(1)将铜绿假单胞工程菌株PH2活化后，将菌液接种到含有多环芳烃的培养基中进行降解。(2)降解5-9天后，分析工程菌株对多环芳烃污染物的降解情况。本专利技术的优点表现为：铜绿假单胞菌本身就具有对多环芳烃的降解能力，构建的基因工程菌具有更好的降解能力，且具有如下特性：能够表达较高的多环芳烃环裂解双加氧酶活性；降解基因和特异性启动子的导入提高了菌株对多环芳烃的降解能力。这为以后多环芳烃污染物的降解修复提供了新方法，为菌株的进一步开发和改造提供了实验基础。附图说明图1是重组载体pBBR1MCS-5-oprL-catA2构建示意图；图2是从铜绿假单胞菌中克隆得到catA2特异性条带。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步说明：本专利技术还提供了所述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：(1)从铜绿假单胞菌SA1中克隆得到编码环裂解双加氧酶的降解基因——catA2基因，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；作为优选，特异性oprL启动子核苷酸序列如SEQIDNo.2；作为优选，选择广宿主质粒pBBR1MCS-5为载体。catA2基因和oprL启动子分别克隆至pBBR1MCS-5载体中，转入受体细胞中克隆扩增，筛选阳性克隆得到目标重组载体pBBR1MCS-5-oprL-catA2(如图1所示)：①将降解基因catA2，通过PCR方法在片段两端分别加上HindⅢ和XbaⅠ酶切位点，同样将pBBR1MCS-5质粒使用FastDigest内切酶HindⅢ和XbaⅠ进行酶切，连接转化提质粒得到表达载体pBBR1MCS-5-catA2；②将合成得到的oprL基因，通过PCR方法在片段两端分别加上KpnⅠ和HindⅢ酶切位点，同样将pBBR1MCS-5-catA2质粒使用FastDigest内切酶KpnⅠ和HindⅢ进行酶切，连接转化提质粒得到表达载体pBBR1MCS-5-oprL-catA2；(2)利用铜绿假单胞菌SA1作为宿主，将重组载体pBBR1MCS-5-oprL-catA2通过电击法转化入铜绿假单胞菌种，构建得到多环芳烃降解工程菌——工程铜绿假单胞菌PH2。实施例1从铜绿假单胞SA1中克隆catA2基因(1)提取铜绿假单胞SA1的全基因组和质粒；(2)根据编码多环芳烃环裂解酶的降解基因序列，设计特异性引物以特异性性引物catAF和catAR。catAF：5’-ATGACCGTGAAGATATCTCACAC-3’catAR：5’-TTAGATTTCTTGCAAGGCTCTCG-3’以基因组和质粒为模板，扩增得到一段900bp左右特异性条带，如图2所示，大小符合catA2基因大小；(3)将扩增产物送至北京金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果见SEQIDNo.1所示。将测序结果和编码多环芳烃环裂解酶的catA2基因进行比对，结果表明两者序列完全一致，则可以确定从菌株SA1中克隆得到了catA2基因。实施例2重组表达载体pBBR1MCS-5-oprL-catA2的构建(1)将降解基因catA2，通过PCR方法在片段两端分别加上HindⅢ和XbaⅠ酶切位点，使用FastDigest内切酶HindⅢ和XbaⅠ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多环芳烃降解工程菌，其特征是pBBR1MCS‑5‑oprL‑catA2表达载体通过在广宿主质粒插入编码环裂解双加氧酶的降解基因和相关启动子oprL基因构建得到，再将表达载体导入受体菌株铜绿假单胞菌SA1得到一种多环芳烃降解工程菌——工程铜绿假单胞菌PH2。

【技术特征摘要】
1.一种多环芳烃降解工程菌，其特征是pBBR1MCS-5-oprL-catA2表达载体通过在广宿主质粒插入编码环裂解双加氧酶的降解基因和相关启动子oprL基因构建得到，再将表达载体导入受体菌株铜绿假单胞菌SA1得到一种多环芳烃降解工程菌——工程铜绿假单胞菌PH2。2.如权利要求1所述的工程菌，其特征是多环芳烃编码基因的序列，设计特异性引物：catAF：5’-ATGACCGTGAAGATATCTCACAC-3’，catAR：5’-TTAGATTTCTTGCAAGGCTCTCG-3’。3.如权利要求1所述的工程菌的构建方法，其特征是包括以下步骤：(1)从铜绿假单胞菌SA1中克隆得...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾晓强，贺赟，姜大伟，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12