一种生产胞二磷胆碱的重组微生物及生产胞二磷胆碱的方法技术

本发明专利技术提供了一种生产胞二磷胆碱的重组微生物以及利用该重组微生物生产胞二磷胆碱的方法，对胞二磷胆碱、胆碱及磷酸胆碱的降解及利用基因进行了敲除，并对CTP降解基因编码的5‑羟基‑CTP二磷酸酶进行了敲除，阻断了CDP前体CTP的分流。对胞二磷胆碱合成的关键酶进行了适量表达，包括将氯化胆碱磷酸化到磷酸胆碱的胆碱激酶，以及催化磷酸胆碱与CDP反应生成胞二磷胆碱的胆碱磷酸胞苷酰转移酶。另对嘧啶核苷途径进行了基因工程改造，解除合成途径的反馈抑制。通过生物发酵方法将重组菌株在5升发酵罐可达到20g/L以上的胞二磷胆碱产量，实现工业化量产，同时胞二磷胆碱的生产成本低，污染少，绿色环保，具有较高的推广应用价值。

A Recombinant Microorganism for the Production of Cytodiphosphate Choline and a Method for the Production of Cytodiphosphate Choline

The invention provides a recombinant microorganism for producing Cytidine Diphosphate Choline and a method for producing Cytidine Diphosphate Choline by using the recombinant microorganism. The degradation and utilization genes of cytidine diphosphate choline, choline and phosphocholine are knocked out, and the 5 hydroxy CTP diphosphatase encoded by the CTP degradation gene is knocked out, thus blocking the shunt of the precursor CTP of CDP. The key enzymes involved in the synthesis of CDP-choline were appropriately expressed, including the phosphorylation of choline chloride to choline phosphate kinase, and the choline phosphate cytidyl transferase catalyzing the reaction of choline phosphate with CDP to produce CDP. In addition, the pyrimidine nucleoside pathway was genetically engineered to remove the feedback inhibition of the synthesis pathway. The recombinant strain can produce more than 20 g/L CdP-choline in 5-liter fermentor by bio-fermentation method, which can realize industrial production. At the same time, the production cost of CdP-choline is low, pollution is low, and environmental protection is green, so it has high popularization and application value.

【技术实现步骤摘要】
一种生产胞二磷胆碱的重组微生物及生产胞二磷胆碱的方法
本专利技术属于生物
，具体地，涉及一种生产胞二磷胆碱的重组微生物，利用重组微生物生产胞二磷胆碱以及利用该重组微生物通过生物方法生产胞二磷胆碱。
技术介绍
胞二磷胆碱（Citicoline，CDP-choline，缩写CDPC）属于核苷的衍生物，由5’胞苷酸和磷酸胆碱合成而成。分子式C14H26N4O11P2，相对分子质量488.323962，沸点851.4°C。它是从胆碱生成磷脂酰胆碱的中间体，存在于所有细胞中，是磷脂合成的主要辅酶，通过促进卵磷脂的合成而改善脑的功能。用于治疗急性颅脑外伤和脑手术后意识障碍等。胞二磷胆碱的生产主要有化学法和生物法两种。化学合成法以胞苷酸和磷酸胆碱为底物，甲苯磺酰氯为缩合剂，在N-二甲基甲酰胺作用下生成胞磷胆碱钠，但该方法反应转化率低，副产物多，成本高且污染大。生物法生产胞二磷胆碱有比较长的历史。主要是单酶/多酶催化法或单菌/多菌转化法。1975年ShojiShirota等研究酵母合成胞二磷胆碱及其影响因素（ShojiShirota1975,AgrBiolChen,35(3):1469-147本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产胞二磷胆碱的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物具有如下特征的一个或者多个：1）不产生参与胞二磷胆碱和/或胆碱和/或磷酸胆碱再利用的酶；2）催化氯化胆碱生成磷酸胆碱的胆碱激酶的活性高于野生型微生物；3）催化磷酸胆碱生成胞二磷胆碱的胞苷酰转移酶的活性高于野生型微生物；4）将氯化胆碱转运至胞内的内膜蛋白胆碱转运蛋白的活性高于野生型微生物。

【技术特征摘要】
1.一种生产胞二磷胆碱的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物具有如下特征的一个或者多个：1）不产生参与胞二磷胆碱和/或胆碱和/或磷酸胆碱再利用的酶；2）催化氯化胆碱生成磷酸胆碱的胆碱激酶的活性高于野生型微生物；3）催化磷酸胆碱生成胞二磷胆碱的胞苷酰转移酶的活性高于野生型微生物；4）将氯化胆碱转运至胞内的内膜蛋白胆碱转运蛋白的活性高于野生型微生物。2.根据权利要求1所述的生产胞二磷胆碱的重组微生物，其特征在于：所述参与胞二磷胆碱再利用的酶包括胞苷-5'-二磷酸醇水解酶、胞苷-5'-二磷酸-二酰基甘油焦磷酸酶；所述参与胆碱再利用的酶包括胆碱脱氢酶；所述参与磷酸胆碱再利用的酶包括碱性磷酸酯酶、酸性磷酸酶。3.根据权利要求1所述的生产胞二磷胆碱的重组微生物，其特征在于：所述胆碱激酶包括酿酒酵母来源的CKI1或EKI1，或链球菌来源的LicC。4.根据权利要求1所述的生产胞二磷胆碱的重组微生物，其特征在于：所述胞苷酰转移酶包括酿酒酵母来源的PCT1、CDS1、ECT1；或大肠杆菌来源的CdsA、IspD、MocA、KdsB、Cca；或链球菌来源的LicC；或假丝酵母菌来源的CD36_40620。5.根据权利要求1所述的生产胞二磷胆碱的重组微生物，其特征在于：所述胆碱转运蛋白包括大肠杆菌来源的BetT。6.根据权利要求1-5任一项所述的生产胞二磷胆碱的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物包括大肠杆菌。7.根据权利要求6所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡志浩，江君君，范俊英，刘爱霞，秦天宇，田锋，张凯林，王欣彤，
申请(专利权)人：苏州华赛生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32