【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及转运蛋白yahn在l-肌肽生产中的应用。
技术介绍
1、l-肌肽(β-丙氨酰-l-组氨酸)及其类似物(如高肌肽和鹅肌肽),是广泛存在于哺乳动物的大脑、肌肉和其他重要组织中的天然活性二肽。自该活性肽发现的一百多年来，已有大量的研究发现或者证明l-肌肽具有显著的抗氧化、消除胞内自由基、抗衰老等活性，并且在临床上用于高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡、抗肿瘤、促进伤口愈合等方面的辅助治疗，由于其抗氧化的活性强,毒副作用低并具有多种生理活性，该活性肽及其衍生物在医药、保健、卫生、化妆品等领域已有广泛的应用，市场空间广阔。
2、l-肌肽的化学合成已被广泛报道，成为目前生产l-肌肽的商业方式。化学生产过程需要与受保护的氨基酸和剧毒试剂进行许多复杂的反应。此外，恶劣的反应条件和高能耗也使该过程对环境不友好等诸多不利因素。
3、近年来，国内外有研究者开始致力于利用酶或者细胞在温和的条件下合成l肌肽。heyland jan[1]等人开发了一种大肠杆菌dmpasyn细胞可以直接用作合成l-肌肽的全细胞生物催化剂，从而避免耗时且材料密集型的蛋白质纯化，但是该方法不能够直接催化廉价的β-丙氨酸和l-组氨酸合成l-肌肽。l-肌肽酶是存在于细胞内和细胞外的二肽酶。其中人源血清肌肽酶(cn1)可催化xaa-his二肽的水解，以维持血清中肌肽的平衡。chiaki inaba等人[2]以非受保护氨基酸为底物合成肌肽，利用人源肌肽酶cn1基因，与α-凝集素的细胞壁粘附域连接，构建了基于酿酒酵母细胞表面展示
4、yahn与大肠杆菌k-12[aleshin99]中的高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出蛋白rhtb同源。yahn是高丝氨酸/苏氨酸抗性(rhtb)家族的成员。全局调节因子lrp调节yahn的表达。
5、[1]heyland j,antweiler n,lutz j,et al.simple enzymatic procedure forl-carnosine synthesis:whole-cell biocatalysis and efficient biocatalystrecycling[j].microb biotechnol.2010jan；3(1):74-83.
6、[2]inaba c,higuchi s,morisaka h,et al.synthesis of functionaldipeptide carnosine from nonprotected amino acids using carnosinase-displaying yeast cells[j].appl microbiol biotechnol.2010may；86(6):1895-902.
技术实现思路
1、针对上述不足，本专利技术提供了一种yahn在l-肌肽生产中的应用，经验证，yahn能够显著提高过表达重组菌株发酵生产l-肌肽的产量，本专利技术是yahn转运l-肌肽技术的首次公开。
2、本专利技术中转运蛋白yahn简称为yahn，其编码基因为yahn。
3、本专利技术的技术方案包括：
4、一方面，本专利技术提供了一种转运蛋白yahn或其编码基因在转运l-肌肽中的应用，所述的yahn的氨基酸序列如seq id no：1所示。
5、具体地，所述的转运蛋白用于促进l-肌肽向胞外转运。
6、具体地，所述的编码基因通过在表达l-肌肽的细胞中过表达发挥作用。
7、进一步具体地，所述的编码基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
8、进一步具体地，所述的过表达为构建过表达质粒。
9、优选地，所述的过表达质粒为pez07-yahn。
10、进一步具体地，所述的表达l-肌肽的菌株为基因工程菌株。
11、优选地，所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株。
12、进一步优选地，所述菌株的保藏编号为cgmcc no.27382。
13、另一方面，本专利技术提供了转运蛋白yahn或其编码基因在生产l-肌肽中的应用，所述yahn的氨基酸序列如seq id no：1所示。
14、具体地，所述应用为提高l-肌肽产量。
15、又一方面，本专利技术提供了一种yahn编码基因，所述种yahn编码基因yahn核苷酸序列如seq id no：2所示。
16、又一方面，本专利技术提供了一种表达质粒的构建方法，包括以下步骤：
17、s1扩增yahn基因片段，获得目的基因；
18、s2将目的基因与酶切回收的载体片段进行克隆构建；
19、s3转化细胞，筛选阳性克隆，提取质粒验证，得到含有编码基因yahn的表达质粒。
20、优选地，步骤s1以大肠杆菌w3110基因组为模板，利用引物对扩增yahn基因片段。
21、优选地，步骤s1中所述的引物对为ptr104-f/ptr104-r；所述的引物ptr104-f的核苷酸序列如seq id no：3所示；所述的引物ptr104-r的核苷酸序列如seq id no：4所示。
22、进一步优选地，所述步骤s1中所述的yahn氨基酸序列如seq id no：1所示，yahn编码基因序列如seq id no：2所示。
23、优选地，步骤s2中所述的载体为pez07载体。
24、进一步优选地，步骤s2中所述的目的基因yahn与pez07载体片段的纳摩尔比为1：2。
25、优选地，步骤s2中所述的酶为ncoi限制性内切酶和/或xhoi限制性内切酶。
26、优选地，步骤s3中所述转化细胞为加入感受态细胞，进行热击转化。
27、进一步优选地，步骤s3所述的感受态细胞选自tg1感受态细胞、dh 5α感受态细胞、jm109感受态细胞中的一种或多种。
28、进一步优选地，步骤s3所述的感受态细胞为tg1感受态细胞。
29、优选地，步骤s3中所述的加入感受态细胞后，包括将其混匀放置42℃热击2min，冰浴2min的步骤。
30、优选地，步骤s3所述的壮观霉素浓度为80 150mg/l。
31、进一步优选地，步骤s3所述的壮观霉素浓度为100mg/ml。
32、又一方面，本专利技术提供了一种l-肌肽的生产方法，所述生产方法包括构建过表达yahn编码基因的基因工程菌株，所述的yahn编码基因核苷酸序列为seq id no：2，所述的基因工程菌株为保藏编号为cgmcc no.27382的大肠杆菌菌株。...
【技术保护点】
1.一种转运蛋白YahN或其编码基因在转运L-肌肽中的应用，其特征在于，所述YahN的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的转运蛋白用于促进L-肌肽向胞外转运；所述的编码基因通过在表达L-肌肽的菌株中过表达发挥作用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的过表达为构建过表达质粒；所述的过表达质粒为pEZ07-yahN。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的生产L-肌肽的菌株为基因工程菌株，所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株，保藏编号为CGMCCNo.27382。
6.一种转运蛋白YahN或其编码基因在生产L-肌肽中的应用，其特征在于，所述YahN的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
7.一种YahN编码基因，其特征在于，所述YahN编码基因yahN核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
8.一种L-肌肽的生产方法，其特征在
9.一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株于2023年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCCNo.27382，分类命名为大肠埃希氏菌。
10.权利要求9所述的基因工程菌株的应用，其特征在于，所述应用为在生产L-肌肽中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种转运蛋白yahn或其编码基因在转运l-肌肽中的应用，其特征在于，所述yahn的氨基酸序列如seq id no：1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的转运蛋白用于促进l-肌肽向胞外转运；所述的编码基因通过在表达l-肌肽的菌株中过表达发挥作用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如seq idno：2所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的过表达为构建过表达质粒；所述的过表达质粒为pez07-yahn。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的生产l-肌肽的菌株为基因工程菌株，所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株，保藏编号为cgmccno.27382。
6.一种转运蛋白yahn或其编码基因在生产l-肌肽中的应...
【专利技术属性】
技术研发人员：闵杰，江君君，田锋，胡文刚，黄祝渊，
申请(专利权)人：苏州华赛生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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