一种生产胞嘧啶的重组微生物及方法技术

本发明专利技术提供了一种生产胞嘧啶的重组微生物及其构建方法和应用，属于生物技术领域

【技术实现步骤摘要】
一种生产胞嘧啶的重组微生物及方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种生产胞嘧啶的重组微生物及方法
。

技术介绍

[0002]胞嘧啶
(C)
是组成
DNA
的四种基本碱基之一，存在于
DNA
和
RNA
中
。
其外观为白色片状结晶，
100℃
时失水，
300℃
时成棕色，
320
‑
325℃
分解
。1g
胞嘧啶能溶于
130mL
水，微溶于乙醇，不溶于乙醚
。
胞嘧啶有刺激性，其分子主要以氨
‑
酮式
(Amino
‑
Keto)
和氨
‑
烯醇式
(Amino
‑
Enol)
两种异构形式存在
。
常温常压下，胞嘧啶主要以氨
‑
酮式异构体形式存在
。
胞嘧啶主要可参与三种反应类型：
(1)
嘧啶环上的氮原子反应，主要有
N1‑
烷基化和氧化反应
、N3‑
烷基化和氧化反应；
(2)
碳原子的取代反应，主要有亲电和亲核反应，亲电反应易于进行，而亲核反应不易进行；
(3)
侧链上的氨基与酸酐等物质发生缩合反应
。
[0003]胞嘧啶应用前景广泛，其是合成化工<br/>、
农药
、
医药的重要中间体
。
在农业上，以胞嘧啶为原料用于合成胞嘧啶核苷肽类高效低毒的广谱农药抗生素；在医药领域，胞嘧啶主要用于抗艾滋病药物，治疗慢性乙肝的药物，抗真菌药物5‑
氟胞嘧啶，以及抗肿瘤药物吉西他滨
、
依诺他滨的制备
。
因此，对胞嘧啶的合成方法进行研究具有十分重要的意义
。
[0004]胞嘧啶合成工艺路线较多，按照反应类型主要分为官能团转化法和
Pinner
合成法
。
官能团转化法主要是以尿嘧啶
(U)
或
2,4
‑
二硫嘧啶
(DTP)
为原料通过一系列化学反应，使官能团发生转化，从而合成胞嘧啶；
Pinner
合成法主要是以3‑
乙氧基丙烯腈
(EA)
和
3,3
‑
二乙氧基丙腈
(DP)
或
EA
和
DP
的混合物为原料合成胞嘧啶
。
此外，利用微生物发酵生产胞嘧啶逐渐成为可能
。
例如，专利
CN201711213776.1
公开了一种微生物发酵生产胞嘧啶核苷的方法，通过微生物在发酵罐内生长代谢将培养基原料
(
主要为葡萄糖
)
转化为胞嘧啶核苷，同时通过采用最优化的培养基配方法，最优的过程控制方法式，达到微生物最佳产物积累状态
。
专利
CN201910602231.2
则公开了一种生产胞嘧啶的重组微生物及生产胞嘧啶的方法，所述的重组微生物具有至少一个如下特征：
1)
重组微生物不降解或不利用胞嘧啶；
2)
重组微生物体外积累胞嘧啶；
3)
重组微生物超表达编码核糖激酶的基因；
4)
重组微生物能同时利用葡萄糖和核糖；
5)
重组微生物的编码核糖及相关化合物的调控蛋白质的基因缺失或没有功能；采用上述重组微生物菌种能够发酵单独生产胞嘧啶，或生产胞嘧啶和胞苷混合物
。
[0005]然而，采用专利
CN201910602231.2
所述的重组微生物发酵法生产胞嘧啶，产量提高有限，且菌种放大存在困难
。
因此，亟需寻找一种提高微生物发酵生产胞嘧啶的产量，且易于操作，可应用工业化生产的方法
。

技术实现思路

[0006]针对以上问题，本专利技术提供了一种生产胞嘧啶的重组微生物及方法
。
本专利技术意外发现敲除核苷水解酶
(RihA)
的编码基因，同时过表达核苷酸磷酸核苷酶
(PpnN)
能够进一步催化生成胞嘧啶，提高胞嘧啶的产量
。
该重组微生物可用于胞嘧啶的工业化生产，且易于操
作，达到绿色环保低成本的胞嘧啶的生产
。
[0007]术语：
[0008]1、
胞嘧啶：如无特殊说明，本专利技术中的英文简称“C”指胞嘧啶，其分子式为
C4H5N3O
，分子量
111.10
，结构式如下式
(1)
所示
。
[0009][0010]2、
重组微生物：如无特殊说明，本专利技术中的中文名称“重组微生物”指经过人为处理后的微生物；所述的人为处理包括但不限于：基因敲除
、
基因抑制
、
基因沉默
、
基因插入
、
基因突变
、
外源表达或过表达基因等本领域所有可以实现基因操作的技术手段
。
[0011]3、
宿主菌：如无特殊说明，本专利技术中的中文名称“宿主菌”指待进行人为处理的微生物
。
[0012]4、
种子液：如无特殊说明，本专利技术中的中文名称“种子液”指经微生物经试管斜面活化
、
扁平或摇瓶培养或种子罐逐级扩大培养后，获得的含有一定微生物数量，活力
、
质量较优的微生物培养液
。
[0013]5、
高产：如无特殊说明，本专利技术中的“高产”指胞嘧啶产量高于亲本微生物
。
[0014]6、
低产：如无特殊说明，本专利技术中的“低产”指胞嘧啶产量低于亲本微生物
。
[0015]7、
外源表达或过表达：在相对于本专利技术使用时应被广义地认为包括在相同条件下与亲本微生物的一种或多种蛋白质
(
包括编码一种或多种蛋白质的一种或多种核酸
)
表达水平相比所述蛋白质表达
(
包括核酸表达
)
的任何增加
。
不应被认为意指所述蛋白质
(
或核酸
)
以任何具体水平表达
。
[0016]8、
亲本微生物：是本专利技术的微生物所来源于的微生物
。
本专利技术的微生物可以通过任何方法例如人工或天然选择
、
突变或基因重组而产生
。
亲本微生物可以是天然存在的微生物
(
即野生型微生物
)
或先前曾被修饰过但是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种生产胞嘧啶的重组微生物，其特征在于：所述的重组微生物包括以下特征：
(1)
核苷水解酶的含量或活性降低，和
/
或，敲除或敲降核苷水解酶的编码基因；
(2)
核苷酸磷酸核苷酶的含量或活性提高，和
/
或，核苷酸磷酸核苷酶的编码基因增加
、
拷贝数或活力提高
。2.
根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于：所述的核苷水解酶包括
RihA、RihB、RihC
中的一种或多种
。3.
根据权利要求2所述的重组微生物，其特征在于：所述的核苷水解酶为
RihA。4.
根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于：所述的核苷酸磷酸核苷酶包括
PpnN。5.
根据权利要求1‑4任一项所述的重组微生物，其特征在于：所述的微生物包括大肠杆菌
、
芽孢杆菌
、
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凯林，胡志浩，江君君，田锋，王欣彤，
申请(专利权)人：苏州华赛生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：