一种以制造技术

本发明专利技术公开了一种以

【技术实现步骤摘要】
一种以tmRNA为靶标的抗结核药物筛选模型及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别是一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型及其筛选方法和应用
。

技术介绍

[0002]结核病是危害仅次于艾滋病的全球第二大传染性疾病，全球约
1/3
的人口感染过结核分枝杆菌，世界卫生组织最新数据显示，
2021
年有
160
万例死于结核病，其中包括
18.7
万例
HIV
感染者
。
结核病的致病菌结核分枝杆菌是胞内寄生菌，被巨噬细胞吞噬后可进入持留状态，是导致结核病长疗程用药
、
治疗后易复发并产生耐药的主要原因，也是结核病控制形势比较严峻的原因之一
。
[0003]目前广泛应用的一线抗结核药物吡嗪酰胺
(PZA)
，主要发挥胞内杀细菌作用，低
pH
环境下作用最强，其与异烟肼，利福平，乙胺丁醇组成的“黄金四联”，可将结核病治疗周期由9‑
12
个月缩短至6个月，其对持留状态的结核分枝杆菌有很好的杀伤作用，而对处于生长状态的结核分枝杆菌则作用甚微，
PZA
进入人体后，在胞内被吡嗪酰胺酶水解，生成吡嗪酸，吡嗪酸与核糖体蛋白
S1
结合后，通过抑制反式翻译过程发挥抗结核作用
。
[0004]目前，所有测序的细菌中均发现了反式翻译过程的存在，该过程的突变会直接影响各种细菌的生存能力和毒力，这提示我们，针对反式翻译过程的抑制物，可能可以作为一种广谱的抗生素
。
此外，该过程在动物中不存在，所以针对该过程的抑制物，可能不会对宿主产生伤害，是一种低毒
、
高效的新型抗生素
。
[0005]由于
MDR
‑
TB
和
XDR
‑
TB
患者数量逐年上升，成为结核病防控工作的重大挑战
。
急切需要通过研究新的信号通路，开发新的药物靶标，筛选新的抗结核药物来解决这一问题
。
[0006]截至目前，尚无基于抑制反式翻译过程的新型药物获批上市
。
因此，有必要构建基于此靶点的高通量筛选模型，筛选抑制结核分枝杆菌新型化合物，对于应对结核病长疗程用药
、
治疗后易复发并产生耐药等问题，是十分必要的
。
本专利技术提供一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型及其筛选方法
。

技术实现思路

[0007]为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型及其筛选方法，本专利技术的筛选模型操作简单
、
检测样品微量
、
检测结果快速的优点，药物筛选工作量小，实验快速精确，实验结果重复性好，可用于新型抗结核药物的筛选与开发
。
[0008]为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：
[0009]一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型，包括：
ssrA
基因敲除菌株
Δ
ssrA M.smegmatis mc
2 155。
[0010]前述的一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型，构建缺失
ssrA
基因的突变耻
垢分枝杆菌的方法包括如下步骤：
[0011]步骤一，取耻垢分枝杆菌
M. smegmatis mc
2 155
作为模板，扩增
ssrA
上下游同源臂，产物纯化回收；
[0012]步骤二，上下游同源臂纯化回收的
DNA
产物互为模板与引物做重叠
PCR
，产物纯化回收；
[0013]步骤三，重复扩增的重叠片段连接到
T
载体；
[0014]步骤四，制备大肠杆菌 DH5
α
感受态细胞；
[0015]步骤五，将大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞转化成转化子，取转化子为模板做
PCR
鉴定，提取“T
‑
886”质粒；
[0016]步骤六，将
pAL75
质粒与“T
‑
886”质粒分别单酶切后，得到“dif
‑
hyg
‑
dif”抗性盒子和线性“T
‑
886”质粒，纯化回收，去磷酸化；
[0017]步骤七，将酶切后的“dif
‑
hyg
‑
dif”抗性盒子和线性“T
‑
886”质粒用连接酶连接；
[0018]步骤八，取连接产物加入到感受态细胞中，转化转入大肠杆菌
DH5
α
，经过
PCR
鉴定后，得到质粒“T
‑
H
‑
886”；
[0019]步骤九， 提取测序正确的质粒“T
‑
H
‑
886”用
EcoRV
切下“上游臂
‑
hyg
‑
下游臂”片段；
[0020]步骤十，制备含有质粒
pJV53
的
M.smegmatis mc
2 155
感受态细胞；
[0021]步骤十一，将含有质粒
pJV53
的
M.smegmatis mc
2 155
感受态细胞进行电转化，经过含有抗生素的培养液培养后
PCR
鉴定阳性克隆；
[0022]步骤十二，鉴定抗生素基因片段，经过培养丢失抗生素抗性后得到
Δ
ssrA
耻垢分枝杆菌
。
[0023]前述的一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型，扩增
ssrA
上下游同源臂的
PCR
扩增体系包括：上游引物
F1、
上游引物
R1、
下游引物
F2、
下游引物
R2。
[0024]前述的一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型，鉴定抗生素基因片段中抗生素选用潮霉素
(Hyg)
片段，
PCR
扩增鉴定使用的引物为：
HygF、HygR。
[0025]一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型，为结核分枝杆菌
tmRNA
高通量筛选模型，结核分枝杆菌
tmRNA
高通量筛选模型包括：野生型菌株命名为“luc
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型，其特征在于，包括：
ssrA
基因敲除菌株
Δ
ssrA M.smegmatis mc
2 155。2.
根据权利要求1所述的一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型，其特征在于，构建缺失
ssrA
基因的突变耻垢分枝杆菌的方法包括如下步骤：步骤一，取
M.smegmatis mc
2 155
作为模板，扩增
ssrA
上下游同源臂，产物纯化回收；步骤二，上下游同源臂纯化回收的
DNA
产物互为模板与引物做重叠
PCR
，产物纯化回收；步骤三，重复扩增的重叠片段连接到
T
载体；步骤四，制备大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞；步骤五，将大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞转化成转化子，取转化子为模板做
PCR
鉴定，提取“T
‑
886”质粒；步骤六，将
pAL75
质粒与“T
‑
886”质粒单酶切后，分别得到“dif
‑
hyg
‑
dif”抗性盒子和“T
‑
886”线性质粒，纯化回收，去磷酸化；步骤七，将酶切后的“dif
‑
hyg
‑
dif”和“T
‑
886”线性质粒用连接酶连接；步骤八，取连接产物加入到大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞中，转化转入
DH5
α
，经过
PCR
鉴定后，得到质粒“T
‑
H
‑
886”；步骤九，提取测序正确的质粒“T
‑
H
‑
886”用
EcoRV
切下“上游臂
‑
hyg
‑
下游臂”片段；步骤十，制备含有质粒
pJV53
的
M.smegmatis mc
2 155
感受态细胞；步骤十一，将含有质粒
pJV53
的
M.smegmatis mc
2 155
感受态细胞进行电转化，经过含有抗生素的平板培养后
PCR
鉴定阳性克隆；步骤十二，鉴定抗生素基因片段，经过培养丢失抗生素抗性后得到
Δ
ssrA
耻垢分枝杆菌
。3.
根据权利要求2所述的一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型，其特征在于，所述扩增
ssrA
上下游同源臂的
PCR
扩增体系包括：上游引物
F1、
上游引物
R1、
下游引物
F2、
下游引物
R2。4.
根据权利要求3所述的一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型，其特征在于，所述鉴定抗生素基因片段中抗生素选用潮霉素
(Hyg)
片段，
PCR
扩增鉴定使用的引物为：
HygF、HygR。5.
一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型，其特征在于，为结核分枝杆菌
tmRNA
高通量筛选模型，所述结核分枝杆菌
tmRNA
高通量筛选模型包括：野生型菌株命名为“luc
‑
trpAt”(MS
‑
U7)
和敲除菌株命名为“luc
‑
trpAt”(
Δ
‑
U7)。6.
根据权利要求5所述的一种以
tmRNA
为靶标的抗结核药物筛选模型，其特征在于，构建结核分枝杆菌
tmRNA
高通量筛选模型的方法包括如下步骤：步骤一，将
pGL3
‑
Basic
质粒加入到权利要求3所述的大肠杆菌
DH5
α
感受态中，在含有抗生素的培养基上培养，提取质粒，保存；步骤二，以
pGL3
‑
Basic
为模板，设计一对含有
trpAt
转录终止子序列的引物，去扩增荧光素酶编码序列
luc
，从而将拷贝
trpAt
转录终止子序列插入到
luc
终止密码子的前面，扩增得到
1698bp
的
luc
‑
trpAt
片段；步骤三，将穿梭质粒
pSODIT
‑2转化到权利要求3所述的大肠杆菌
DH5
α
感受态中，在含有
抗生素的培养基上培养，提取
pSODIT
‑2质粒，保存；步骤四，将
luc
‑
trpAt
片段与提取的
pSODIT
‑2质粒用限制性核酸内切酶进行酶切，酶切的产物经鉴定后用连接酶将片段与载体连接；步骤五，取连接产物转化到大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞中...

【专利技术属性】
技术研发人员：冀磊，姜婷婷，蒋锦琴，付益修，花扣珍，刘小香，赵芯，刘名帅，赵奇奇，
申请(专利权)人：杭州医学院，
类型：发明
国别省市：