一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用，该菌株的构建方法包括：

【技术实现步骤摘要】
一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高产生物膜的工程菌株：解淀粉芽孢杆菌
LPN
‑
18Nfen36
的构建及应用
。

技术介绍

[0002]解淀粉芽孢杆菌
(Bacillus amyloliquefaciens)
是芽孢杆菌属
、
产孢子的兼性厌氧型革兰氏阳性菌，细胞多呈杆状，广泛分布于食物
、
水
、
植物表面和动物肠道以及土壤环境等多个生态系统
。
迄今为止，解淀粉芽孢杆菌由四个种属组成：解淀粉芽孢杆菌
(B.amyloliquefaciens)
，暹罗芽孢杆菌
(B.siamensis)
，贝莱斯芽孢杆菌
(B.velezensis)
和中村芽孢杆菌
(B.nakamurai)。
尽管解淀粉芽孢杆菌由不同的菌株组成，具有不同的性质和用途，但就菌株安全角度而言，它们被认为是一种安全
、
无毒且可应用于生产的工业微生物
。1998
年，解淀粉芽孢杆菌已被美国食品和药物管理局
(FDA)
认定为安全微生物
(Generally Recognized as Safe,GRAS)
，可应用于食品工业和动物饲料的发酵生产中
。
随着高通量测序技术的发展，目前已完成全基因簇测序的解淀粉芽孢杆菌有
50
余株，其中形成生物膜，生成芽孢和分泌抗菌肽是它们的共性，随着功能基因簇的挖掘和研究进一步开展，解淀粉芽孢杆菌的生物功能和待开发的工业应用逐渐被明晰，其在食品加工
、
生物制药和环境治理方面具有广泛的应用前景
。
而作为一种著名的根际微生物，其在农业生产的作物增产和病虫害防御方面已有广泛的研究，在其发挥植物促生中，生物膜使其与作物黏附
、
发挥生物促生作用的前提，因此研究解淀粉芽孢杆菌生物膜合成，优化其合成路径具有重要意义
。
[0003]生物膜
(Biofilm)
是由微生物分泌出的胞外基质将自身包裹而形成的一种聚集体，能够帮助其附着于生物或非生物体表面
。
生物膜被认为是地球上最广泛和最成功的生命模式之一，在大多数自然环境中，生物膜也是微生物最主要的生活方式
。
目前研究表明，生物膜可以保护微生物免受极端环境的影响，可以提高微生物对紫外线辐射
、
极端温度和
pH、
金属离子
、
营养匮乏
、
抗生素等不良条件的耐受性
。
生物膜对不良环境的耐受性能够为微生物种群创造合适的栖息地，使得微生物之间物质和信息的交换更加稳定，因此是微生物在自然环境中生长的一种自我保护机制
。
生物膜中微生物的形态结构及其对环境因素的敏感性和生物学特性与浮游微生物也都有所不同，生物膜的三维结构为微生物提供了天然的屏障和保护层
。
此外，胞外基质中的固定微生物比浮游微生物更能抵御外界不良环境
。
在农林业中，定殖于植物根际或植物内的细菌
、
真菌等各类微生物，会与植物组成一种植物
‑
微生物共生体，而生物膜能够帮助微生物更好的提高自身在复杂环境中的生存竞争能力，是生防细菌占据生态位的重要存在形式，能够帮助其抵御不良环境，同时筑起一道防止植物病原微生物入侵的“围墙”，以此来适应和抵御外界环境的压力
。
[0004]sRNA(Small sRNA)
是一种长约
50
‑
500nt
的基因表达调控因子，在细菌中通过与靶基因或靶蛋白配对结合，调控细菌的生理功能应对各种环境变化
。
作为一类重要的生理生
化调控因子，在细菌中普遍存在且高度保守
。
关于
sRNA
的研究在革兰氏阴性细菌的细胞膜合成研究较为透彻，而在革兰氏阳性菌的生物膜合成调控作用知之甚少
。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，本专利技术的工程菌株展现出高生物膜合成能力，其在农作物促生增产和维持根系健康生长中具有良好的应用前景
。
[0006]本专利技术还提供所述基因工程菌的构建方法与应用
。
[0007]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，所述基因工程菌以解淀粉芽孢杆菌为出发菌株，将非编码
RNA Fen36
转化到解淀粉芽孢杆菌所得
。
[0008]非编码
RNA Fen36
的
DNA
序列如下：
[0009]>SEQ ID NO.1
[0010]CAATGATAAAGGATTGCAGAGACTCTAATGAGACGTAGATGACGTTTTT
[0011]TCCTTCGGCTTTTCCGAAGTAGACGTTGTTCGGCACGTCATAGTTGGCC
[0012]TTCATATAGTTTTCCACATCCGTTACATCGCTTGAATCGGCAAGCGCGC
[0013]GCTGGCTGTTTGATTTCACATTCTGCACGGCATCGTAAATCGTAAAGTT
[0014]GTACGTGCCCAAGTATTTCACCAGATAGTTTCGGTCAAATGAGCGTGTC
[0015]AAAAGCTCAGGACGATCGGATTCCGCGACGGCGAGGTTGATCAGGAA
[0016]CACAAGCACGGCGGAAGCCAAAACGATTCTGAATGATTTCTTCGCCGG
[0017]TTTTTCAGCCGTTTTTTTCATCTTAAG
[0018]作为优选，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌
LPB
‑
18N。
[0019]本专利技术所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0020](1)
将基因
Fen36
融合至表达载体
pHT43
，得到重组载体
pHT43
‑
fen36
；
[0021](2)
将重组载体
pHT43
‑
fen36
转化至解淀粉芽孢杆菌，得到生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌
。
[0022]其中，步骤
(1)
中以解淀粉芽孢杆菌基因组为模板，设计引物扩增
Fen36
序列，<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以解淀粉芽孢杆菌为出发菌株，将非编码
RNA Fen36
转化到解淀粉芽孢杆菌所得，所述非编码
RNA Fen36
的序列如
SEQ ID NO.1
所示
。2.
根据权利要求1所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌为优选为解淀粉芽孢杆菌
LPB
‑
18N。3.
一种权利要求1所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
将非编码
RNA Fen36
融合至表达载体
pHT43
，得到重组载体
pHT43
‑
fen36
；
(2)
将重组载体
pHT43
‑
fen36
电转化至解淀粉芽孢杆菌，得到工程菌株解淀粉芽孢杆菌
LPB
‑
18Nfen36。4.
根据权利要求3所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤
(1)
中以解淀粉芽孢杆菌基因组为模板，以
fen36
‑
F/R
为引物扩增非编码
RNA Fen36
序列，
Pgrac
的扩增模板来自表达载体
pHT43
，利用
BamHⅠ和
KpnⅠ双酶切，酶切验证成功后，以
PgracF/R
为引物扩增完整的
Pgrac
片段；将扩增的
Pgrac
片段与非编码
RNA Fen36
通过重叠验证
PCR
连接，待验证成功后，采用无缝克隆进行融合片段得到
Pgrac
...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢河东，顾成源，杨攀平，耿程欣，赵玉萍，黎钟豪，赵立，
申请(专利权)人：淮阴工学院，
类型：发明
国别省市：