能够稳定表达抗原多糖-蛋白生物偶联相关生物元件并提高产物产量的工程菌及其应用制造技术

本申请公开了能够稳定表达抗原多糖

【技术实现步骤摘要】
能够稳定表达抗原多糖
‑
蛋白生物偶联相关生物元件并提高产物产量的工程菌及其应用


[0001]本申请涉及基因工程
，具体涉及能够稳定表达抗原多糖
‑
蛋白生物偶联相关生物元件并提高产物产量的工程菌及其应用
。

技术介绍

[0002]近年来，随着对细菌蛋白糖基化系统的不断解析，一种被称为蛋白多糖偶联技术
(Protein
‑
glycan coupling technologies
，
PGCT)
的生物法制备多糖结合疫苗技术逐渐取代化学交联法成为新的热门研究领域
。
生物法结合疫苗的生产需要四种关键元件：糖基工程菌株
、
糖基转移酶
、
糖链表达基因簇及底物蛋白
。
根据糖基转移酶的不同，生物法生产多糖结合疫苗主要分为两类，基于空肠弯曲杆菌的
N
‑
寡糖转移酶
PglB
的
N
‑
糖基化结合疫苗以及基于脑膜炎奈瑟菌的
O
‑
寡糖基转移酶
PglL
的
O
‑
糖基化结合疫苗
。
该方法通过在细菌宿主细胞中使用糖基转移酶，将重组表达的多糖与蛋白质进行生物催化偶联
。
与化学交联方法相比，
PGCT
的主要优点是体内偶联只需一步便可完成糖蛋白的生产，只需进一步纯化便可获得相对均一的终产物，无需经过分别纯化载体蛋白和多糖后，再纯化交联获得终产物的繁琐过程，因此其生产结合疫苗成本更低，可扩展性更强，下游纯化步骤更少，无需多次纯化反复质检，质控便捷
。
其中，
PglB
主要用于开发还原端含有
HexNAc
糖的生物结合疫苗，如志贺氏菌
、
金黄色葡萄球菌和肠外致病性大肠杆菌
(ExPEC)
等
。
而
PglL
底物特异性更加宽松，几乎能够将任何糖从十一碳烯基焦磷酸载体转移到蛋白质上，从而克服了空肠弯曲杆菌
N
‑
连接的糖基化系统的局限性
。
[0003]另一方面，随着基因编辑技术
CRISPR
的兴起，基因编辑变得更加快速便捷
。
合成生物学技术的快速发展和兴起，为糖基工程底盘细胞的构建提供了新思路
。
微生物底盘的开发是合成生物学领域的一个关键课题，为构建具有改进的生物制造效率的细胞工厂提供了基础
。
大肠杆菌
(Escherichia coli)
作为研究微生物遗传
、
生理和代谢的模式菌株，由于遗传操作工具多样以及遗传背景清晰等优势，已经成为重要的底盘细胞之一
。
但由于
PGCT
需要的关键元件较多，因此生产多糖
‑
蛋白偶联产物时，大多需要两到三个表达质粒
。
基于质粒的表达系统虽然有构造简便的优势，但是含有质粒的工程菌株在遗传稳定性方面存在明显不足，尤其在不能使用抗生素的实际生产环境下，这些质粒经常会从细胞中丢失
。
另外，多拷贝质粒会显著改变正常的宿主细胞的新陈代谢，进一步增加了质粒的不稳定性，这种代谢负担会影响质粒复制和质粒编码基因的翻译
。

技术实现思路

[0004]在开展
PGCT
技术研究中，经过一系列实验发现了一个基因簇
yfdGHI
如果缺失，能够有效改进终产物
——
抗原多糖
‑
蛋白生物偶联产物的生物合成产量
。
该基因簇
yfdGHI(yfdG、yfdH、yfdI)
属于
O
抗原侧链修饰基因簇，它是由
yfdG
葡萄糖转位酶
、yfdH
蛋白
、yfdI
葡糖基转移酶组成，核苷酸序列如
SEQ ID NO.33
所示
。yfdH
在通过
yfdG
易位之前将葡萄糖
从
UDP
葡萄糖转移到十一碳烯焦磷酸酯，缺失掉该基因簇后，有可能释放了更多的十一碳烯焦磷酸酯，这些物质可以用于目标聚糖糖链的合成，因而促进了终产物抗原多糖
‑
蛋白生物偶联产物的产量
。
[0005]因此，本专利技术提供了一种能够稳定表达抗原多糖
‑
蛋白生物偶联相关生物元件并提高产物产量的工程菌，该工程菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除大肠杆菌基因组上的
yfdGHI
基因簇并整合了糖基转移酶基因和底物蛋白基因；所述
yfdGHI
基因簇的核苷酸序列如
SEQ ID NO.33
所示
。
[0006]进一步的，所述糖基转移酶为
PglL
，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.26
所示；和
/
或，所述底物蛋白为携带糖基化位点改造后的
SpyCatcher
蛋白，核苷酸序列如
SEQ ID NO.27
所示
。
[0007]所述工程菌还敲除了大肠杆菌基因组上的
waaL
基因和
/
或
wbbH
‑
L
基因簇
。
[0008]所述出发菌株为大肠杆菌
W3110。
[0009]采用糖基转移酶基因和底物蛋白基因替换所述
wbbH
‑
L
基因簇
。
[0010]使用
CRISPR
‑
Cas9
方法将糖基转移酶基因和底物蛋白基因整合到大肠杆菌基因组上
。
[0011]将糖基转移酶基因和底物蛋白基因整合到大肠杆菌基因组上的方法包括：
[0012](1)
使用质粒
pTargetF
当模板，使用引物
W3110
‑
wbbH
‑
L
‑
N20
和
ptf
‑
R
进行
PCR
扩增，并构建新的质粒
pTargetF
‑
wbbH
‑
L
；
[0013](2)
构建同源臂
A
‑
LacI
‑
pglL
‑
Spycatcher4573
‑
rrnB
‑
B
[0014]其中
A
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.30
所示；
B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种能够稳定表达抗原多糖
‑
蛋白生物偶联相关生物元件并提高产物产量的工程菌，其特征在于，该工程菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除大肠杆菌基因组上的
yfdGHI
基因簇并整合了糖基转移酶基因和底物蛋白基因；所述
yfdGHI
基因簇的核苷酸序列如
SEQ ID NO.33
所示
。2.
根据权利要求1所述的能够稳定表达抗原多糖
‑
蛋白生物偶联相关生物元件并提高产物产量的工程菌，其特征在于，所述糖基转移酶为
PglL
，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.26
所示；和
/
或，所述底物蛋白为携带糖基化位点改造后的
SpyCatcher
蛋白，核苷酸序列如
SEQ ID NO.27
所示
。3.
根据权利要求2所述的能够稳定表达抗原多糖
‑
蛋白生物偶联相关生物元件并提高产物产量的工程菌，其特征在于，所述工程菌还敲除了大肠杆菌基因组上的
waaL
基因和
/
或
wbbH
‑
L
基因簇
。4.
根据权利要求3所述的能够稳定表达抗原多糖
‑
蛋白生物偶联相关生物元件并提高产物产量的工程菌，其特征在于，以大肠杆菌
W3110
为出发菌株
。5.
根据权利要求4所述的能够稳定表达抗原多糖
‑
蛋白生物偶联相关生物元件并提高产物产量的工程菌，其特征在于，采用糖基转移酶基因和底物蛋白基因替换所述
wbbH
‑
L
基因簇
。6.
根据权利要求4所述的能够稳定表达抗原多糖
‑
蛋白生物偶联相关生物元件并提高产物产量的工程菌，其特征在于，使用
CRISPR
‑
Cas9
方法将糖基转移酶基因和底物蛋白基因整合到大肠杆菌基因组上
。7.
根据权利要求5或6所述的能够稳定表达抗原多糖
‑
蛋白生物偶联相关生物元件并提高产物产量的工程菌，其特征在于，将糖基转移酶基因和底物蛋白基因整合到大肠杆菌基因组上的方法包括：
(1)
使用质粒
pTargetF
当模板，使用引物
W3110
‑
wbbH
‑
L
‑
N20
和
ptf
‑
R
进行
PCR
扩增并构建新的质粒
pTargetF
‑
wbbH
‑
L
；
(2)
构建同源臂
A
‑
LacI
‑
pglL
‑
Spycatcher4573
‑
rrnB
‑
B
其中，
A
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.30
所示；
B
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.31
所示；
LacI
为转录调控元件
,
其核苷酸序列如
SEQ ID NO.25
所示；
pglL
为糖基转移酶，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.26
所示；
SpyCatcher4573
为融合了糖基化识别位点的重组蛋白，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.27
所示；
rrnB
为转录终止子序列，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.28
所示；
(3)
取同源臂
A
‑
LacI
‑
pglL
‑
Spycatcher4573
‑
rrnB
‑
B 400ng
与质粒
pTargetF
‑
wbbH
‑
L
同时电转入含有
pCas
的大肠杆菌感受态细胞中
。8.
根据权利要求7所述的能够稳定表达抗原多糖
‑
蛋白生物偶联相关生物元件并提高产物产量的工程菌，其特征在于，所述工程菌的制备方法包括如...

【专利技术属性】
技术研发人员：王恒樑，朱力，刘琰，吴军，潘超，郭艳，孙鹏，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：