一种具有超强硝化功能的硝化细菌制造技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，涉及一种具有超强硝化功能的硝化细菌，命名为GYNB6820，保藏日期为2018年4月23日，保藏编号为CGMCC No.15640，本发明专利技术克服现有硝化细菌的缺陷，得到的新型硝化细菌生长快，周期短，硝化能力强。

A Nitrifying Bacteria with Super Nitrification Function

The invention belongs to the field of microbial technology, and relates to a nitrifying bacteria with super nitrification function, named GYNB6820. The storage date is April 23, 2018, and the storage number is CGMCC No. 15640. The invention overcomes the shortcomings of the existing nitrifying bacteria and obtains a new type of nitrifying bacteria with fast growth, short cycle and strong nitrification ability.

【技术实现步骤摘要】
一种具有超强硝化功能的硝化细菌
本专利技术属于微生物
，涉及一种具有超强硝化功能的硝化细菌，用于去除水产养殖中水体的亚硝酸盐，具有硝化能力强、培养周期短等优势。
技术介绍
近20年来，水产养殖是世界范围内食品领域增长最快的行业。我国水产养殖业在改革开放以后得到迅猛发展，产业布局发生了重大变化，已从沿海地区和长江、珠江流域等传统养殖区扩展到全国各地，养殖规模向集约化、规模化、工厂化方向发展。水产养殖过程中，尤其是到养殖的中后期，随着养殖密度的增高，投喂饵料量加大，养殖水体中极易蓄积大量的残饵、动植物排泄物、死亡残体等含氮有机物，导致养殖水体中氨氮和亚硝酸盐严重超标。高浓度的氨氮或亚硝酸盐毒性较高，易导致养殖动物体质的免疫力下降，抗应激能力差，易受病原菌的侵袭，引起水产动物疾病的大面积爆发。目前，主要通过物理、化学和微生物等方法降低水体中氨氮和亚硝酸盐浓度。物理法成本较高，化学法容易造成水体污染，微生物法具有绿色环保、无残留、安全可靠等特点，水体中氮素释放的重要途径之一是通过生物脱氮实现，而硝化过程是生物脱氮的限制性步骤，其核心是硝化细菌。硝化细菌包括两个细菌亚群，一类是亚硝化菌，它主要是把氨氧化成亚硝酸盐；另一类是硝化菌，主要是把亚硝酸盐氧化成硝酸盐。硝化细菌是一种化能自养需氧型的细菌，其能量利用率不高，故生长较慢。目前已知的硝化细菌硝化能力一般，生长也比较缓慢，培养周期较长。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有消化细菌存在的缺陷，本专利技术采用细胞融合技术生成一种同时兼具硝化能力强和生长速度快的新型硝化细菌，为水产养殖的氨氮、亚硝酸盐的问题提供环保、高效的解决方案。为了达到上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：一种具有超强硝化功能的硝化细菌，命名为GYNB6820，保藏日期为2018年4月23日，保藏编号为CGMCCNo.15640，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京。本专利技术的新型消化细菌由菌种编号为AATCC®25387™的菌种A与菌种编号为ATCC®51921™的菌种B通过细胞融合、筛选而得到。现有的硝化细菌中，并非具有这两者缺陷的菌种都可以得到本专利技术的新型硝化细菌，申请人从众多的现有硝化细菌中筛选出AATCC®25387™和ATCC®51921™，能够高效融合，并且能达到预期的效果，具有硝化能力强、培养周期短。关于硝化细菌的融合，现有技术中的报道基本上没有，所以想通过细胞融合的方式来得到优势硝化细菌，并不是一件容易的事，也不是本领域的普通技术人员通过现有的细胞融合手段就能够实现的。本专利技术所述硝化细菌的构建方法包括如下步骤：融合亲本的增殖培养：所述融合亲本的培养基的制备方法为：向1000ml去离子水中加入NaNO21g，蛋白胨20g，酵母粉15g，葡萄糖10g，K2HPO4·3H2O14g，NaH2PO4·2H2O7g，MgSO4·7H2O5g，pH6.8，121℃下高温灭菌20min。所述融合亲本的增殖培养方法为：取样品分别接种于硝化细菌增殖培养基中，在32℃、200r/min下恒温振荡培养24小时。细胞脱壁处理：采用酶解法使硝化细菌细胞脱壁，生成原生质体。原生质体融合：将获得的两种硝化细菌原生质体混合到一起，加入促融剂聚乙二醇（PEG），在32℃、200r/min下恒温振荡培养24小时。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。这样就可以将不同的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。上述作为促融剂的聚乙二醇的分子量在1000-3000之间，硝化细菌的细胞融合经常得不到任何的融合细菌，申请人通过N次的实验和对融合方法的不断改进，偶然发现聚乙二醇的分子量在1000-5000之间，会有融合细菌的出现。而在1000-3000之间，融合成功的几率会大幅提高。现有技术中一般用分子量在4000的聚乙二醇，从现有技术得知，分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，但是对本申请的硝化细菌则不然。融合子检出：所述融合子检出培养基的制备方法为：向1000ml去离子水中加入NaNO25g、蛋白胨20g、酵母粉15g、葡萄糖10g、K2HPO4·3H2O14g、NaH2PO4·2H2O7g、MgSO4·7H2O5g，pH6.8，121℃下高温灭菌20min。所述融合子检出的方法为：采用“梯度稀释法”在检出培养基进行固体平板分离培养，于32℃恒温培养箱中培养24小时后挑取单菌落，在32℃、200r/min下恒温振荡培养24小时，继续进行平板分离，反复重复此操作，筛选出长势较好的单菌落。将这些单菌落进行增殖培养，从中挑选出一株硝化能力强、生长速度快的最优菌株。通过融合得到的新型细菌，在进行融合子检出时，最开始申请人采用的是亲本硝化细菌培养所用的培养基，能筛选出硝化细菌，但是检出的硝化细菌的特性并不能满足申请人的要求，总是与亲本相似，要么生长速度快，要么硝化能力强，但是难以兼具。后来申请人通过对培养基进行改进，在已有的培养基成分中加入维生素C，得到本申请中的硝化细菌。而且对维生素C的加入量也有要求，每1000ml去离子水配制而成的培养基中加入5-12μg。菌种保存：所述硝化细菌菌种的保存方法为：菌液与甘油的混合比例为3:7，-80℃保存。硝化能力测定：所述硝化细菌的硝化能力测定方法为：将硝化细菌加入到含有亚硝酸盐的水体中，测定亚硝酸盐的降解情况。通过实施上述技术方案，本专利技术克服现有硝化细菌的缺陷，得到的新型硝化细菌生长快，周期短，硝化能力强。具体实施方式下面结合具体实例进一步阐述本专利技术，这些实例仅用于说明本专利技术，而不是用于限制本专利技术要求保护的范围。实施例1：本专利技术具有超强硝化功能的硝化细菌的构建方法，是采用细胞融合的技术手段，将生长速度较快的菌种AAATCC®25387™与硝化能力较强的的菌种BATCC®51921™进行融合、筛选，通过细胞内基因的遗传重组，生成兼具二者优势的新型硝化细菌GYNB6820。融合亲本的培养基的制备：向1000ml去离子水中加入NaNO21g，蛋白胨20g，酵母粉15g，葡萄糖10g，K2HPO4.3H2O14g，NaH2PO4.2H2O7g，MgSO4.7H2O5g，pH6.8，121℃下高温灭菌20min。融合亲本的增殖培养：取硝化能力较强的菌种B和生长速度较快的菌种A的样品分别接种于硝化细菌增殖培养基中，在32℃、200r/min下分别恒温振荡培养15天和2天。细胞脱壁处理：采用酶解法使硝化细菌细胞脱壁，用溶菌酶分别对菌种A和菌种B进行处理，使细胞脱壁，生成原生质体。原生质体融合：将获得的两种硝化细菌原生质体混合到一起，加入促融剂（分子量在1000-3000之间聚乙二醇（PEG）），在32℃、200r/min下恒温振荡培养24小时。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。这样就可以将不同的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。融合子检出：所述融合子检出培养基的制备方法为：向1000ml去离子水中加入NaNO25g、蛋白胨20g、酵母粉15g、葡萄糖10g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有超强硝化功能的硝化细菌，命名为 GYNB6820 ，保藏日期为 2018年4月23日，保藏编号为CGMCC No.15640 。

【技术特征摘要】
1.一种具有超强硝化功能的硝化细菌，命名为GYNB6820，保藏日期为2018年4月23日，保藏编号为CGMCCNo.15640。2.如权利要求1所述一种具有超强硝化功能的硝化细菌，其特征在于，由菌种编号为AATCC®25387™的菌种A与菌种编号为ATCC®51921™的菌种B通过细胞融合、筛选而得到。3.如权利要求2所述一种具有超强硝化功能的硝化细菌，其特征在于，获得的具体步骤包括：融合亲本的增殖培养；细胞脱壁处理；原生质体融合；融合子检出；菌种保存。4.如权利要求3所述一种具有超强硝化功能的硝化细菌，其特征在于，所述细胞融合采用使用聚乙二醇作为促融剂，融合后在30-32℃、200r/min下恒温振荡培养24小时。5.如权利要求4所述一种具有超强硝化功能的硝化细菌，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为1000-3000。6.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：田祺，凌勇斌，徐安清，张富军，
申请(专利权)人：湖州易康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33