一种纳豆激酶、其表达载体的构建及生产方法技术

本发明专利技术公开了一种纳豆激酶、其表达载体的构建及生产方法。它是以纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）基因组数据为模板，扩增纳豆激酶基因，通过自主复制性质粒和整合型质粒的方法在地衣芽孢杆菌中表达。本发明专利技术还对表达框的启动子和信号肽进行选择，得到一种能够在地衣芽孢杆菌中高效分泌表达的重组菌株，并且实现了在50L发酵罐中的小试生产，产品活力达到15000FU/g。

【技术实现步骤摘要】
一种纳豆激酶、其表达载体的构建及生产方法
本专利技术属于生物
，具体为改变启动子和信号肽的方法提高纳豆激酶在地衣芽孢杆菌中表达的方法，以及在50升发酵罐中小试生产的方法。
技术介绍
纳豆是起源于秦汉时期，是中国和日本的传统发酵豆制品。日本学者须见洋行对纳豆提取物进行研究时发现其具有溶解血栓的作用，并将之命名为纳豆激酶(nattokinase)。纳豆激酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶，由一条275个氨基酸残基的多肽链折叠而成，无二硫键，分子量27-28KDa.纳豆激酶在纳豆杆菌中以酶原的形式分泌到胞外，随后信号肽和前肽被切除，形成具有活性的纳豆激酶。纳豆激酶具有显著的溶血栓作用，与尿激酶、链激酶、蚓激酶相比，纳豆激酶更加温和，不会引起出血，半衰期长达8小时。并且该酶可以通过肠壁计入血液，口服就可以发挥溶血栓作用。目前，纳豆激酶的生产是以纳豆杆菌发酵产生纳豆激酶，经过后期的提取纯化得到产品，但是直接发酵的酶活较低，市售的发酵纳豆的活力仅在10FU/g左右，日本营养健康食品协会规定纳豆激酶的每日正常维持量应该不低于2000FU，仅靠使用发酵纳豆不能满足溶血栓的需要，并且发酵纳豆具有特殊的气味本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳豆激酶，其特征在于，该纳豆激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种纳豆激酶，其特征在于，该纳豆激酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种纳豆激酶表达载体，其特征在于，包括纳豆激酶基因序列的自主复制型表达质粒，其中纳豆激酶基因序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求2所述的纳豆激酶表达载体，其特征在于，所述自主复制型表达质粒包括任何能够在地衣芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒。4.根据权利要求3所述的纳豆激酶表达载体，其特征在于，所述自主复制型表达质粒包括pWB980、pHP13、pHT01、pHT43、pHT304、pMK3、pMK4、pHCMC04、pHCMC05、pMA5或pBE中的任意一种。5.根据权利要求2所述的纳豆激酶表达载体，其特征在于，所述自主复制型表达质粒的启动子可由以下启动子中的任意一种所替代：PamyQ、PaprE、Pveg、PlepA、PnprE、PsodA、PxylA、PahpF、PwprA。6.权利要求2所述的纳豆激酶表达载体的构建方法，其特征在于，通过引物扩增SEQIDNO.1序列，回收扩增产物，连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选后利用限制性内切酶酶切T载体和自主复制型表达质粒，通过DNA连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到。7.根据权利要求6所述的纳豆激酶表达载体的构建方法，其特征在于，扩增SEQIDNO.1序列的引物为NK-F：GCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGAAAAG和NK-R:TTATTGTGCAGCTGCTTGTACGTTGA。8.一种整合型纳豆激酶表达载体，其特征在于，包括整合了权利要求1所述的SEQIDNO.1序列的整合型质粒。9.根据权利要求8所述的整合型纳豆激酶表达载体，其特征在于，所述整合型质粒包括任何能够在地衣芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的并且能够通过同源重组的方法整合到染色体上的质粒。10.根据权利要求8所述的整合型纳豆激酶表达载体，其特征在于，所述整合型质粒为pDG364，pMLK83，pDG1661，pDG1662，pDG1728，pDG1730，pDG1664，pAX01，pSG1170，pSG1729，pMAD，pCBS，pCBS595，pCBS221，pCBS345或pCBS412中的任意一种。...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆兆新，孟凡强，李金良，吕凤霞，
申请(专利权)人：南京福斯弗瑞生物科技有限公司，南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32