The present disclosure provides a method and a kit for tracking the source of a nucleic acid target by barcode markers of the target when it breaks into smaller fragments. Nucleic acid target was captured on solid carrier in vitro by cloning and positioning of nucleic acid bar code template. Millions of nucleic acid targets can be processed simultaneously in a large-scale parallel manner without requiring additional partitioning. The captured targets are broken into small fragments, and the target-specific barcode sequence is labeled on each fragment as the identification of their original targets. These nucleic acid target tracking methods can be used in many applications of genome-wide sequencing and targeted sequencing.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】跟踪核酸靶标来源以用于核酸测序的方法和试剂盒
本公开大体上涉及用于改进的核酸测序的方法和试剂盒。
技术介绍
本专利技术属于基因组学的
更具体来说，本专利技术属于核酸测序的
核酸测序可以为多种多样的生物医学应用提供信息，所述生物医学应用包括诊断学、预后学、药物基因组学、以及法医生物学。测序可以利用基本低通量方法，包括马克萨姆-吉尔伯特测序(Maxam-Gilbertsequencing)(化学修饰的核苷酸)和桑格测序(Sangersequencing)(链终止)方法；或高通量下一代方法，包括大规模并行焦磷酸测序、边合成边测序、边连接边测序、半导体测序等。对于大部分的测序方法，在引入测序仪器中之前，需要处理样品，如核酸靶标。举例来说，可以将样品片段化、扩增或与标识物附连。独特的标识物常常用于标识特定样品的来源。大部分的测序方法产生相对短的测序读段(read)，长度从数十个碱基到数百个碱基不等，并且由于有限的测序读段长度而不能产生完整的单倍型相信息。
技术实现思路
本专利技术提供了用于当核酸靶标被断裂成更小段时通过条形码标记跟踪核酸靶标来源的方法和试剂盒。可以在固体载体(例如珠粒、微粒、载片、平板或流动池)上克隆扩增或克隆合成用作条形码的多个核酸序列。本专利技术中的条形码序列的设计允许产生数十亿个不同的条形码并且每个条形码序列含有用于提高测序准确度的特征。通过这些克隆定位的核酸条形码模板在固体载体上体外捕获具有或不具有修饰的核酸靶标。使用转座酶和可转座的DNA来促进核酸靶标的片段化和条形码标记。可以以大规模并行方式同时处理数百个、数千个或数百万个核酸...
【技术保护点】
1.一种通过条形码标记来跟踪核酸靶标来源的方法，所述方法包括：a.提供上面固定有克隆条形码模板或半克隆条形码模板的固体载体，其中每个条形码模板包含中心条形码和至少一个侧接柄部序列；b.提供多个核酸靶标；c.使所述核酸靶标与所述固体载体附连；以及d.将所述核酸靶标断裂成片段，其中每个片段与所述固体载体上的条形码模板附连。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.01 US 62/301,9671.一种通过条形码标记来跟踪核酸靶标来源的方法，所述方法包括：a.提供上面固定有克隆条形码模板或半克隆条形码模板的固体载体，其中每个条形码模板包含中心条形码和至少一个侧接柄部序列；b.提供多个核酸靶标；c.使所述核酸靶标与所述固体载体附连；以及d.将所述核酸靶标断裂成片段，其中每个片段与所述固体载体上的条形码模板附连。2.权利要求1的方法，其中使所述核酸靶标与所述固体载体附连在不将总的多个核酸靶标内每个核酸靶标与另一个核酸靶标分区的情况下发生。3.权利要求1的方法，其中所述固体载体选自珠粒、微粒、载片、平板、流动池以及其组合，并且其中当所述固体载体是物理上可分离的，如珠粒或微粒时，所述条形码模板被克隆或半克隆地固定到整个表面上，并且当所述固体载体是连续平坦表面，如载片、平板或流动池时，所述条形码模板作为可分离的克隆簇或半克隆簇被固定到所述表面上。4.权利要求1的方法，所述方法还包括提供转座酶。5.权利要求4的方法，其中所述转座酶选自野生型Tn转座酶、野生型Mu转座酶、野生型Ty转座酶和野生型Tc转座酶或它们的突变型或标记型以及其组合。6.权利要求5的方法，其中所述转座酶是MuA转座酶或Tn5转座酶或其组合。7.权利要求1的方法，所述方法还包括提供可转座的DNA，其中在与带条形码的固体载体附连之前，将所述核酸靶标与转座酶和所述可转座的DNA混合以形成核酸-转座体复合物。8.权利要求7的方法，其中所述可转座的DNA含有转座子DNA部分，其中所述转座子DNA选自野生型Tn转座子DNA、野生型Mu转座子DNA、野生型Ty转座子DNA和野生型Tc转座子DNA或它们的突变型以及其组合。9.权利要求8的方法，其中所述转座子DNA是Tn5转座子DNA或MuA转座子DNA或其组合。10.权利要求7的方法，其中所述可转座的DNA可与固定的条形码模板附连并且包含：a.可与所述条形码模板的3'末端连接的5'末端转座子连接链；以及b.所述转座子互补链的与所述条形码模板的3'末端重叠的3'末端突出端；或c.在一端与所述条形码模板的3'末端重叠并且在另一端与所述转座子连接链的5'末端重叠的接头寡核苷酸。11.权利要求1的方法，其中使核酸靶标与所述条形码模板附连包括连接、杂交、交联、转座、引物延伸或扩增，其中所述转座包括转座酶催化反应，其中所述条形码模板含有转座酶结合区。12.权利要求1的方法，其中使所述靶核酸与所述固体载体附连包括实现约1000:1至约0.01:1的所述核酸靶标与所述条形码模板的比率。13.权利要求12的方法，其中所述比率是约100:1至约0.1:1。14.权利要求13的方法，其中所述比率是约10:1至约1:1。15.权利要求1的方法，其中所述断裂包括通过热、蛋白酶、和/或蛋白质变性剂进行处理，而不复制所述核酸靶标的任何部分。16.权利要求1的方法，其中所述断裂包括用引物延伸反应、链置换反应或扩增反应复制所述核酸靶标的一部分。17.权利要求1的方法，所述方法还包括通过化学切割或者经由引物延伸或PCR扩增进行拷贝来从所述固体载体释放条形码标记的核酸片段。18.一种用条形码标记的核酸片段产生核酸文库的方法，所述方法包括按照权利要求1的方法标记核酸靶标。19.权利要求1的方法，所述方法在产生条形码标记的片段之后还包括：a.用针对靶基因、基因或外显子组的第一组引物进行引物延伸反应，以及b.用含有所述条形码模板序列的一部分的通用引物和针对靶基因、基因或外显子组的第二组引物进行扩增反应；其中所述第二组引物被嵌套在所述第一组引物的产物中。20.权利要求1的方法，所述方法在产生条形码标记的片段之后还包括：a.用含有所述条形码模板序列的一部分的通用引物和针对靶基因、基因或外显子组的第一组引物进行扩增；以及b.用含有所述条形码模板序列的一部分的通用引物和针对靶基因、基因或外显子组的第二组引物进行扩增；其中所述第二组引物被嵌套在所述第一组引物的产物中。21.一种通过条形码标记来跟踪核酸靶标来源的方法，所述方法包括：a.提供各自含有克隆或半克隆条形码模板的多个容器，其中每个条形码模板包含中心条形码和至少一个侧接柄部序列；b.提供多个天然或修饰的核酸靶标；c.将所述条形码容器和所述核酸靶标合并成多个分区，以使得大部分的分区各自含有单个容器和至少一个所述核酸靶标，并且所述核酸靶标与所述分区内的多个克隆条形码模板附连；以及d.将所述核酸靶标断裂成片段，其中每个片段与由所述容器提供的条形码附连而不复制所述核酸靶标的任何部分。22.权利要求21的方法，其中所述容器是珠粒、微粒、乳液液滴、或其组合。23.权利要求21的方法，其中所述分区是液滴或乳液液滴。24.权利要求21的方法，所述方法还包括提供转座酶。25.权利要求24的方法，其中所述转座酶选自野生型Tn转座酶、野生型Mu转座酶、野生型Ty转座酶和野生型Tc转座酶或它们的突变型或标记型以及其组合。26.权利要求25的方法，其中所述转座酶是MuA转座酶或Tn5转座酶或其组合。27.权利要求21的方法，所述方法还包括提供可转座的DNA，其中在与所述条形码模板容器合并之前，将所述核酸靶标与所述转座酶和可转座的DNA混合以形成DNA-转座体复合物。28.权利要求27的方法，其中所述可转座的DNA含有转座子DNA部分，其中所述转座子DNA选自野生型Tn转座子DNA、野生型Mu转座子DNA、野生型Ty转座子DNA和野生型Tc转座子DNA或它们的突变型以及其组合。29.权利要求28的方法，其中所述转座子DNA是Tn5转座子DNA或MuA转座子DNA或其组合。30.权利要求27的方法，其中所述可转座的DNA可与固定的条形码模板附连并且包含：a.可与所述条形码模板的3'末端连接的5'末端转座子连接链；以及b.所述转座子互补链的与所述条形码模板的3'末端重叠的3'末端突出端；或c.在一端与所述条形码模板的3'末端重叠并且在另一端与所述转座子连接链的5'末端重叠的接头寡核苷酸。31.权利要求21的方法，其中所述条形码模板是以双链形式或部分双链形式供应的，以使得所述条形码模板的末端含有双链转座酶结合区，在所述双链转座酶结合区处转座酶能够结合并且进行转座反应。32.权利要求21的方法，其中所述条形码模板是以单链形式供应的，其中通过引物退火或引物延伸反应将所述单链条形码模板转化成双链或部分双链条形码模板以使得所述条形码模板的末端含有双链转座酶结合区，在所述双链转座酶结合区处转座酶能够结合并且进行转座反应。33.权利要求21的方法，其中所述附连包括所述靶核酸与所述条形码模板的连接、直接或间接杂交、转座，其中所述转座包括转座酶催化反应，其中所述条形码模板含有转座酶结合区。34.权利要求21的方法，其中所述断裂包括通过热、蛋白酶或其他蛋白质变性剂进行处理，而不...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈宙涛，范龙金，谷俊臣，雷明，
申请(专利权)人：通用测序技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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