核酸序列测定方法技术

提供了使用受损DNA聚合酶检测同源核苷酸的结合测序方法，所述受损DNA聚合酶具有以模板依赖性方式结合引物下游的下一个正确核苷酸的能力，但不具有促进磷酸二酯键形成所需的活性。受损DNA聚合酶的使用允许每次询问一个核苷酸，而不掺入任何核苷酸。标记的核苷酸，如荧光标记的核苷酸，可联合所述受损DNA聚合酶使用以便以快速方式测定同源核苷酸同一性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸序列测定方法相关申请本申请要求2017年1月10日提交的美国临时申请号62/444,733；和2016年4月29日提交的美国临时申请号62/329,489的权益。这些早先申请的公开内容据此以引用的方式整体并入。
本专利技术一般涉及生物
更具体地说，本专利技术涉及核酸测序技术。背景精确的多核苷酸序列测定在许多应用中都非常重要。例如，个体的遗传图谱的全面定义需要测定染色体DNA的长段序列并将其与已知序列的数据库比较。结果可确定倾向性或易感性谱以提供医学见解。同样，肿瘤谱分析也可需要精确的序列测定以测定在治疗开始之前药物治疗方案的功效。同样地，鉴别来自核酸数据库的细菌、病毒或其他病原体也可取决于精确的测序结果。一个以上相同碱基沿着一条核酸链的序列段在混淆精确序列测定的因素之中。这些“均聚物”段可被一些测序方法所忽视，以致于当实际上存在多个时，单个碱基将被检测。一些测序方法还可存在“定相”问题，这可由均聚物段加剧。由于定相的缘故，均聚物段下游的序列测定可变得不明确。已经开发了不同的方法来处理并解决均聚物测序问题。已采用可逆终止核苷酸来确保仅单一核苷酸被酶促掺入到生长的引物中。虽然有效，但可需要后续步骤以便在下一轮模板依赖性掺入可能出现之前从引物中除去化学终止部分。其他方法已经涉及每次仅使用一种核苷酸测量掺入信号的幅度。令人遗憾地，此方法对可被测定的序列长度施加了限制。因此，仍然需要可用于核酸测序的新方法，包括通过核酸链内的均聚物段的精确测序。附图说明图1是示出了结合信号强度(纵轴)随时间或反应进程(横轴)而变化的干涉测量迹线。迹线表示对照聚合酶(“CBT”)和工程化聚合酶(“TDE”)。CBT聚合酶可形成三元复合物并且掺入同源核苷酸。工程化TDE聚合酶保留在同源核苷酸存在下形成三元复合物的能力，但不能在催化Mg2+金属离子存在下掺入任何核苷酸。在结合反应中测试的核苷酸的同一性在迹线下面示出(A＝dATP；C＝dCTP；T＝dTTP；G＝dGTP)。在掺入步骤之后显示对dCTP的更高结合信号和对dGTP的较低结合信号的迹线对应于修饰的TDE聚合酶。
技术实现思路
第一方面，本公开涉及一种确定测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸的方法，所述下一个正确的核苷酸具有与紧邻引物模板核酸中的引物下游的模板链中的下一个碱基互补的碱基。所述方法包括以下步骤：(a)使引物模板核酸与包含受损DNA聚合酶和测试核苷酸的第一反应混合物接触。作为接触的结果，如果测试核苷酸是下一个正确的核苷酸，那么形成包含引物模板核酸、受损DNA聚合酶和测试核苷酸的复合物。用于所述方法中的受损DNA聚合酶大体上不能在镁离子存在下催化磷酸二酯键的形成。还存在以下步骤：(b)测量在测试核苷酸存在下引物模板核酸与受损DNA聚合酶的结合，而测试核苷酸不会化学掺入到引物模板核酸的引物中。接下来有以下步骤：(c)由步骤(b)的结果确定所述测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸。在一个实施方案中，第一反应混合物包含催化二价金属离子。例如，催化二价金属离子可为Mg2+离子或Mn2+离子。在各情况下，测试核苷酸可包含外源性标记。优选地，测试核苷酸的外源性标记具有荧光部分，且步骤(b)涉及测量由测试核苷酸的荧光部分产生的荧光信号。更优选地，受损DNA聚合酶具有外源性标记，且步骤(b)涉及检测受损DNA聚合酶的外源性标记。当在这种情况下，受损DNA聚合酶的外源性标记可包含荧光部分，且步骤(b)可涉及测量由受损DNA聚合酶的荧光部分产生的荧光信号。一般说来，且参考前述实施方案中的任一项，引物可包含游离的3’羟基。更一般说来且参考前述实施方案中的任一项，在步骤(b)之后可有以下另外的步骤：用包含第二聚合酶和第二类型的核苷酸的第二反应混合物替代第一反应混合物，接着将第二类型的核苷酸掺入到引物模板核酸的引物中。例如，第二类型的核苷酸可为可逆终止核苷酸。然而更一般地，且参考前述实施方案中的任一项，第一反应混合物可包含Mg2+离子，且引物可包含3’羟基部分。实际上，所公开的方法的引物可为3’羟基部分。另一方面，本公开涉及一种分离的突变体DNA聚合酶，其具有SEQIDNO:12的氨基酸序列来代替SEQIDNO:13。突变体DNA聚合酶与引物模板核酸分子和同源核苷酸形成三元复合物，并且在Mg2+离子存在下不催化磷酸二酯键形成。优选地，分离的突变体DNA聚合酶包含与此连接的报道部分。另一方面，本公开涉及一种分离的突变体DNA聚合酶，其具有SEQIDNO:14的氨基酸序列来代替SEQIDNO:15。突变体DNA聚合酶与引物模板核酸分子和同源核苷酸形成三元复合物，并且在Mg2+离子存在下不催化磷酸二酯键形成。优选地，分离的突变体DNA聚合酶还包含与此连接的报道部分。另一方面，本公开涉及一种分离的突变体DNA聚合酶，其具有SEQIDNO:3的氨基酸序列，除了在位置355处由谷氨酸替代天冬氨酸之外。突变体DNA聚合酶与引物模板核酸分子和同源核苷酸形成三元复合物，并且在Mg2+离子存在下不催化磷酸二酯键形成。优选地，分离的突变体DNA聚合酶还包含具有半胱氨酸残基的氨基酸的N端序列。更优选地，半胱氨酸残基化学连接到可检测的标记上。另一方面，本公开涉及一种分离的突变体DNA聚合酶，其具有SEQIDNO:3的氨基酸序列，除了在位置532处由谷氨酸残基替代天冬氨酸残基之外。突变体DNA聚合酶与引物模板核酸分子和同源核苷酸形成三元复合物，并且在Mg2+离子存在下不催化磷酸二酯键形成。优选地，分离的突变体DNA聚合酶还包含具有半胱氨酸残基的氨基酸的N端序列。更优选地，半胱氨酸残基化学连接到可检测的标记上。其他方面本公开的其他方面描述于以下编号段落中。1.一种确定测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸的方法，所述下一个正确的核苷酸包含与紧邻引物模板核酸中的引物下游的模板链中的下一个碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：(a)使所述引物模板核酸与包含受损DNA聚合酶和所述测试核苷酸的第一反应混合物接触，从而如果所述测试核苷酸是下一个正确的核苷酸，那么形成包含所述引物模板核酸、所述受损DNA聚合酶和所述测试核苷酸的复合物，且其中所述受损DNA聚合酶大体上不能实现镁催化的磷酸二酯键形成；(b)测量在所述测试核苷酸存在下所述引物模板核酸与所述受损DNA聚合酶的结合，而所述测试核苷酸不会化学掺入到所述引物模板核酸的引物中；以及(c)由步骤(b)的结果确定所述测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸。2.段落1的方法，其中所述受损DNA聚合酶包含含有SEQIDNO:12的多肽序列或含有SEQIDNO:14的多肽序列。3.段落1的方法，其中所述受损DNA聚合酶在二价锰离子存在下催化磷酸二酯键的形成，且其中所述第一反应混合物不含促进磷酸二酯键形成的浓度的二价锰离子。4.段落1-3中任一项的方法，其中所述测试核苷酸包含外源性标记。5.段落3的方法，其中所述测试核苷酸的外源性标记包含荧光部分，且其中步骤(b)包括测量由所述测试核苷酸的荧光部分产生的荧光信号。6.段落1-5中任一项的方法，其中所述受损DNA聚合酶包含外源性标记，且其中步骤(b)包括检测所述受损DNA聚合酶的外源性标记。7.段落6的方法，其中所述受损DNA聚合酶的外源性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸的方法，所述下一个正确的核苷酸包含与紧邻引物模板核酸中的引物下游的模板链中的下一个碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：(a)使所述引物模板核酸与包含受损DNA聚合酶和所述测试核苷酸的第一反应混合物接触，从而如果所述测试核苷酸是下一个正确的核苷酸，那么形成包含所述引物模板核酸、所述受损DNA聚合酶和所述测试核苷酸的复合物，且其中所述受损DNA聚合酶大体上不能实现镁催化的磷酸二酯键形成；(b)测量在所述测试核苷酸存在下所述引物模板核酸与所述受损DNA聚合酶的结合，而所述测试核苷酸不会化学掺入到所述引物模板核酸的引物中；以及(c)由步骤(b)的结果确定所述测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.29 US 62/329,489;2017.01.10 US 62/444,7331.一种确定测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸的方法，所述下一个正确的核苷酸包含与紧邻引物模板核酸中的引物下游的模板链中的下一个碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：(a)使所述引物模板核酸与包含受损DNA聚合酶和所述测试核苷酸的第一反应混合物接触，从而如果所述测试核苷酸是下一个正确的核苷酸，那么形成包含所述引物模板核酸、所述受损DNA聚合酶和所述测试核苷酸的复合物，且其中所述受损DNA聚合酶大体上不能实现镁催化的磷酸二酯键形成；(b)测量在所述测试核苷酸存在下所述引物模板核酸与所述受损DNA聚合酶的结合，而所述测试核苷酸不会化学掺入到所述引物模板核酸的引物中；以及(c)由步骤(b)的结果确定所述测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸。2.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶包含含有SEQIDNO:12的多肽序列或含有SEQIDNO:14的多肽序列。3.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶在二价锰离子存在下催化磷酸二酯键的形成，且其中所述第一反应混合物不含促进磷酸二酯键形成的浓度的二价锰离子。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述测试核苷酸包含外源性标记。5.如权利要求3所述的方法，其中所述测试核苷酸的外源性标记包含荧光部分，且其中步骤(b)包括测量由所述测试核苷酸的荧光部分产生的荧光信号。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶包含外源性标记，且其中步骤(b)包括检测所述受损DNA聚合酶的外源性标记。7.如权利要求6所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶的外源性标记包含荧光部分，且其中步骤(b)包括测量由所述受损DNA聚合酶的荧光部分产生的荧光信号。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述引物包含游离的3’羟基部分。9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其在步骤(b)之后还包括以下步骤：用包含第二聚合酶和第二类型的核苷酸的第二反应混合物替代所述第一反应混合物，接着将所述第二类型的核苷酸掺入到所述引物模板核酸的引物中。10.如权利要求9所述的方法，其中所述第二类型的核苷酸是包含可逆终止部分的可逆终止核苷酸，且其中所述可逆终止核苷酸的掺入产生封端的引物模板核酸分子。11.如权利要求10所述的方法，还包括从所述封端的引物模板核酸分子中除去所述可逆终止部分以再生所述引物模板核酸分子的步骤。12.如权利要求10所述的方法，还包括使用所述封端的引物模板核酸分子代替所述引物模板核酸重复步骤(a)-(c)。13.如权利要求11所述的方法，还包括重复步骤(a)-(c)。14.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶的多肽序列是SEQIDNO:1，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置381之外；或SEQIDNO:1，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置558之外。15.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶的多肽序列是SEQIDNO:2，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置364之外；或SEQIDNO:2，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置541之外。16.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶的多肽序列是SEQIDNO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置355之外；或SEQIDNO:3，除具有被谷氨酸取代的氨基酸位置532之外。17.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反应混合物包含二价镁离子。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含Mg2+离子，且其中所述引物包含3’羟基部分。19.一种用于鉴别有待掺...

【专利技术属性】
技术研发人员：康达斯瓦米·维加亚恩，皮纳尔·伊伊多根，
申请(专利权)人：欧姆尼欧美公司，
类型：发明
国别省市：美国,US