调节单克隆抗体组合物中的非岩藻糖基化物类制造技术

在初始的不进料时期之后将生物反应器细胞培养进料变更至长期或连续进料减少培养物中表达的单克隆抗体的高分子量、酸性电荷和片段物类的水平，并提高培养物中表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的水平。在初始无进料培养基注入时期之后定期岩藻糖注入减少培养物中表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的水平。细胞培养操作可用于调节单克隆抗体物类的水平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】调节单克隆抗体组合物中的非岩藻糖基化物类相关申请本申请要求于2016年1月6日提交的美国申请号62/275,384的优先权，其内容通过引用以其整体结合到本文中。专利
本专利技术一般地涉及蛋白质生物化学领域。更具体地，本专利技术涉及用于生物反应器中重组抗体-表达细胞的营养进料方案，其显著减少所表达的抗体的不期需的同种型，并且能够调节所表达的抗体的非岩藻糖基化物类的水平。专利技术背景各个出版物，包括专利、公布的申请、登录号、技术文章和学术文章在整个说明书中引用。每一这些引用的出版物对于所有目的通过引用以其整体结合到本文中。作为生物制品价格竞争与创新法案(theBiologicsPriceCompetitionandInnovationAct,BPCIA)的一部分，如果数据显示，除了别的以外，产品与已经批准的生物制品“高度相似”，生物药品(在活有机体中生产或从活有机体衍生的)可证明为“生物仿制药(biosimilar)”。生物仿制药产品应至少保留美国食品药品管理局(U.S.FoodandDrugAgency)所批准的生物制品的生物学功能和治疗功效。单克隆抗体(mAbs)可用作治疗蛋白。基于所选择的氨基酸位点从细微到显著的化学修饰，纯化的单克隆抗体最经常以复杂的异质混合物存在。理解这些修饰的影响在生物
相当重要。单克隆抗体具有电荷异质性，这优化获得有利静电相互作用的平衡，并决定其结构、稳定性、结合亲合力、化学性质以及因此，其生物学活性。原料药(drugsubstance)和药品(drugproduct)的一致性连同最大化的贮藏期限对药物开发者和制造者至关重要。原料药和药品的短贮藏期限常常转化为制造者的制造挑战和高生产成本。细胞培养或发酵过程期间，抗体和蛋白可经历称为翻译后修饰的现象。这些修饰促成治疗蛋白中见到的几种形式的异质性。另外，存在制造期间发生的由过程期间给予的应激引起的异质性形式，例如尺寸和电荷，其可由于酶促过程或自发降解和修饰发生。mAbs通过几个不同的机制经历化学修饰，包括氧化、脱酰胺、糖化、异构化和片段化，这导致形成不同的电荷变体和异质性。化学和酶促修饰例如脱酰胺和唾液酸化导致mAbs上的净负电荷增加，并引起pI值降低，从而导致形成酸性变体。C-端赖氨酸切割导致丧失净正电荷，导致酸性变体形成。产生酸性变体的另一个机制为形成各种类型的共价加合物，例如糖化，其中在富含葡萄糖的培养基中制造期间或如果制剂中存在还原糖在储存期间，葡萄糖或乳糖可与赖氨酸或精氨酸残基的伯胺反应。碱性变体的形成可起因于存在一个或多个C-端赖氨酸或脯氨酸酰胺化、琥珀酰亚胺形成、氨基酸氧化或唾液酸去除，这引入额外的正电荷或去除负电荷；两种类型的修饰均引起pI值增加。尽管对在生产和配制期间有效的降解途径有大量知识和经验，当前的挑战为理解上述异质性可能如何影响功效、效能、免疫原性和清除。关于电荷对皮下(SC)给予mAbs的PK的影响知之甚少。通过间质组织进入脉管或淋巴毛细管可对SC给予后的有效药物吸收造成障碍。mAbs的间质扩散可能受其电荷以及其与皮肤真皮下的间质区域中的带负电荷组分的静电相互作用影响。最近，生物仿制药开发的增长和兴趣对于生产生物治疗药物例如mAbs呈现出几个独特挑战。创新分子的发展允许自由定义开发过程的自然过程期间mAb的产品质量属性(PQAs)，和最终地，关键质量属性(CQAs)。该范例继而允许实现潜在稳健的能够处理mAbs的生产平台，候选物产品线(pipeline)可以以最小优化产生。相比之下，生物仿制药分子的开发强加(由参考产品)预定义的产品质量属性范围集合的界线。对过程开发的影响为平台过程可提供的自由可能由于需要符合多个PQAs的定义范围而显著减少。这对于已知生物学相关的或可潜在地生物学相关的那些属性尤其如此，例如上述电荷变体。纯化或减少这样的异质性以达到更同质的群体对过程开发者提出重大挑战。构成电荷变体的异质群体的物类差异常常相当微小，并且其特征与主要的目的mAb群体相似。因此，这些不需要的变体难以有效分离同时维持合理的mAb回收。有必要使这些不需要的变体最少化，以得到更同质的生物仿制药mAbs群体。专利技术概述本公开内容的特征在于用于提高或减少生物反应器中重组表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的水平的方法。另外，本公开内容的特征还在于用于减少生物反应器中重组表达的单克隆抗体的高分子量物类、酸性物类和片段的水平的方法。本文提供用于通过在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，从培养的第1天、第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，向培养物注入约0.5g/L-约5g/L岩藻糖使得细胞表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少，从而减少生物反应器中重组表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的方法。还提供用于通过在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，从培养的第1天、第2天、第3天或第4天开始，并每隔一天继续，直至培养结束，向培养物注入约0.5g/L-约5g/L岩藻糖使得细胞表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少，从而减少生物反应器中重组表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的方法。根据本公开内容的方法，单克隆抗体可特异性结合肿瘤坏死因子(TNF)α。同样地，根据本公开内容的方法，重组细胞可包括哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞、HEK293细胞、Sp2/0细胞或可在生物反应器中生长用于单克隆抗体表达的任何其它合适的细胞)。在任何本文所公开的方法中，可向培养物注入约1g/L-约5g/L岩藻糖、约1g/L-约4g/L岩藻糖、约1g/L-约3g/L岩藻糖、约1g/L-约2g/L岩藻糖和/或约2g/L-约4g/L岩藻糖。在一些实施方案中，岩藻糖以推注注入。在本公开内容的方法的一些实施方案中，培养物为连续进料培养物，其中从培养的第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，在24小时的时期内向培养物进一步连续注入进料培养基。在本公开内容的方法的其它实施方案中，培养物为长期进料培养物，其中从培养的第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，在约18-约20小时的时期内向培养物进一步连续注入进料培养基。示例性的非岩藻糖基化物类包括G0聚糖、G1a聚糖、G1b聚糖、G2聚糖、Man3聚糖、Man4聚糖、Man5聚糖、Man6聚糖、Man7聚糖、Man8聚糖和/或9聚糖，或其任何组合。在一个非限制性的优选的实施方案中，非岩藻糖基化物类为G0聚糖。根据本公开内容的方法，单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约10%或更少，减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约2%-约10%，减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约6%或更少，和/或减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约3%-约7%。在本公开内容的方法中，表达单克隆抗体的重组细胞可在生物反应器中培养至少12天。还提供用于通过在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，然后从培养的第1天、第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，在24小时的时期内连续向培养物注入进料培养基以足以提高单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的水平，从而提高非岩藻糖基化物类的方法。同样地，提供用于通过在生物反应器中培养表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 用于减少生物反应器中重组表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的方法，包括在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，和从培养的第1天、第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，向培养物注入约0.5 g/L‑约5 g/L岩藻糖使得细胞表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.06 US 62/2753841.用于减少生物反应器中重组表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类的方法，包括在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重组细胞，和从培养的第1天、第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，向培养物注入约0.5g/L-约5g/L岩藻糖使得细胞表达的单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少。2.权利要求1的方法，其中所述单克隆抗体特异性结合肿瘤坏死因子(TNF)α。3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述重组细胞包括哺乳动物细胞。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述重组细胞包括中国仓鼠卵巢细胞。5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述重组细胞包括HEK293细胞。6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述重组细胞包括Sp2/0细胞。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述方法包括向培养物注入约1g/L-约5g/L岩藻糖。8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述方法包括向培养物注入约1g/L-约4g/L岩藻糖。9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述方法包括向培养物注入约1g/L-约3g/L岩藻糖。10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述方法包括向培养物注入约1g/L-约2g/L岩藻糖。11.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述方法包括向培养物注入约2g/L-约4g/L岩藻糖。12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所岩藻糖以推注注入。13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述培养物为连续进料培养物，其中从培养的第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，在24小时时期内向培养物进一步连续注入进料培养基。14.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述培养物为长期进料培养物，其中从培养的第2天、第3天、第4天或第5天开始，并每天继续直至培养结束，在约18-约20小时的时期内向培养物进一步连续注入进料培养基。15.权利要求1-14中任一项的方法，其中非岩藻糖基化物类包括G0聚糖、G1a聚糖、G1b聚糖、G2聚糖、Man3聚糖、Man4聚糖、Man5聚糖、Man6聚糖、Man7聚糖、Man8聚糖或Man9聚糖。16.权利要求1-15中任一项的方法，其中非岩藻糖基化物类包括G0聚糖。17.权利要求1-16中任一项的方法，其中单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约10%或更少。18.权利要求1-17中任一项的方法，其中单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约2%-约10%。19.权利要求1-16中任一项的方法，其中单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约6%或更少。20.权利要求1-19中任一项的方法，其中单克隆抗体的非岩藻糖基化物类减少至细胞所表达的单克隆抗体的总量的约3%-约7%。21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述方法包括在生物反应器中培养表达单克隆抗体的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：M桑托罗，KJ乔斯，S马达布施，S甘格洛夫，
申请(专利权)人：安口生物公司，
类型：发明
国别省市：美国,US