包含TNF家族配体三聚体和生腱蛋白结合模块的抗原结合分子制造技术

本发明专利技术涉及新的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与生腱蛋白‑C(TnC)特异性结合的抗原结合模块和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且在于该第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。本发明专利技术进一步涉及生成这些分子的方法和使用它们的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含TNF家族配体三聚体和生腱蛋白结合模块的抗原结合分子专利
本专利技术涉及新的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与生腱蛋白-C(TnC)特异性结合的抗原结合模块和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中所述抗原结合分子的特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，且在于该第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。本专利技术进一步涉及生成这些分子的方法和使用它们的方法。专利技术背景与TNF(肿瘤坏死因子)受体超家族分子相互作用的配体在免疫系统的组织和功能中具有关键作用。在调节正常功能如免疫应答，造血和形态发生的同时，TNF家族配体(也称为细胞因子)在肿瘤发生，移植排斥，脓毒性休克，病毒复制，骨吸收，类风湿性关节炎和糖尿病中起作用(Aggarwal，2003)。TNF配体家族包括编码19个II型(即细胞内N端和细胞外C端)跨膜蛋白的18个基因，其特征在于构成“TNF同源域”(THD)的保守C端域的存在。这个域负责受体结合，因此对TNF配体家族成员的生物学活性至关重要。家族成员之间的序列同一性约为20％-30％(Bodmer，2002)。TNF配体家族的成员以自组装非共价三聚体的形式而发挥其生物学功能(Banneretal.,Cell1993,73,431-445)。因此，TNF家族配体形成能够结合并激活TNFR超家族的相应受体的三聚体。TNF受体超家族成员4-1BB(CD137)首先被鉴定为其表达经由T细胞激活诱导的分子(Kwon和Weissman，1989)。随后的研究证实4-1BB在T和B淋巴细胞(Snell等人，2011；Zhang等人，2010)，NK细胞(Lin等人，2008)，NKT-细胞(Kim等人，2008)，单核细胞(Kienzle和vonKempis，2000；Schwarz等人，1995)，嗜中性粒细胞(Heinisch等人，2000)，肥大细胞(Nishimoto等人，2005)和树突细胞以及非造血来源的细胞如内皮细胞和平滑肌细胞(Broll等人，2001；Olofsson等人，2008)中表达。4-1BB在不同细胞类型中的表达大多可由各种刺激信号诱导和驱动，例如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发，以及通过共刺激分子或促炎细胞因子的受体诱导的信号传导(Diehl等人，2002；vonKempis等人，1997；Zhang等人，2010)。4-1BB配体(4-1BBL或CD137L)的表达受到更多限制，在专职抗原呈递细胞(APC)如B细胞，树突细胞(DC)和巨噬细胞上观察到表达。4-1BBL的诱导表达对于包括αβ和γδT细胞子集二者在内的T细胞以及内皮细胞是特征性的(综述见Shao和Schwarz，2011)。已知CD137信号传导刺激NK细胞的IFNγ分泌和增殖(Buechele等人，2012；Lin等人，2008；Melero等人，1998)以及促进DC激活(表现为其存活和分泌细胞因子的能力增加)，并上调共刺激分子(Choi等人，2009；Futagawa等人，2002；Wilcox等人，2002)。然而，CD137最好被表征为调节T细胞的CD4+和CD8+子集的TCR诱导性激活的共刺激分子。与TCR触发联合，激动性4-1BB特异性抗体增强T细胞的增殖，刺激淋巴因子分泌并降低T淋巴细胞对激活诱导的细胞死亡的敏感性(综述见Snell等人，2011)。与4-1BB抗体对体外T细胞的这些共刺激效应一致，在许多实验性肿瘤模型中将其施用于荷瘤小鼠导致有效的抗肿瘤作用(Melero等人，1997；Narazaki等人，2010)。然而，4-1BB通常仅在与其它免疫调节化合物(Curran等人，2011；Guo等人，2013；Morales-Kastresana等人，2013；Teng等人，2009年；Wei等人，2013)，化疗药物(Ju等人，2008；Kim等人，2009)，肿瘤特异性疫苗接种(Cuadros等人，2005；Lee等人，2011)，或放射治疗(Shi和Siemann，2006)联合给予时才显示其作为抗肿瘤剂的效力。体内消耗实验证明，CD8+T细胞在4-1BB特异性抗体的抗肿瘤作用中起最关键的作用。然而，取决于肿瘤模型或包括抗4-1BB的联合疗法，已经报道了其它类型的细胞如DC，NK细胞或CD4+T细胞的作用(Melero等人1997；Murillo等人；2009；Narazaki等人，2010；Stagg等人，2011)。除了4-1BB激动剂对不同淋巴细胞子集的直接作用之外，通过4-1BB介导的细胞间粘附分子1(ICAM1)和肿瘤血管内皮上的血管细胞粘附分子1(VCAM1)的上调，4-1BB激动剂还可以诱导肿瘤中激活T细胞的浸润和保留(Palazon等人，2011)。4-1BB触发还可以逆转由暴露于可溶性抗原诱导的T细胞无反应性的状态，其可能有助于破坏肿瘤微环境中或慢性感染期间的免疫耐受性(Wilcox等人，2004)。似乎4-1BB激动性抗体在体内的免疫调节特性需要在抗体分子上野生型Fc部分的存在，由此提示Fc-受体结合为此类试剂的药理学活性所需的重要事件，所述试剂被描述为对TNFR超家族的其它的细胞凋亡诱导或免疫调节成员特异的激动性抗体(Li和Ravetch，2011；Teng等人，2009)。然而，在小鼠中，具有功能活性Fc域的4-1BB特异性激动性抗体的全身给药也诱导了与肝毒性相关的CD8+T细胞扩充(Dubrot等人，2010)，在不存在功能性Fc受体的情况下，肝毒性减弱或显著减轻。在人类临床试验(ClinicalTrials.gov，NCT00309023)中，每三周施用一次的有Fc活性的4-1BB激动性抗体(BMS-663513)持续12周诱导了黑素瘤，卵巢癌或肾细胞癌患者的病情稳定。然而，在另一项试验(NCT00612664)中给予的相同抗体引起4级肝炎，导致试验终止(Simeone和Ascierto，2012)。总的来说，可用的临床前和临床数据清楚地表明，有效的4-1BB激动剂的临床需求很高。然而，新一代候选药物不仅会有效地使4-1BB接合在造血细胞和内皮细胞的表面上，而且还能通过除了与Fc受体结合之外的机制来实现这种接合，以避免不可控制的副作用。后者可以通过对肿瘤特异性或肿瘤相关模块的优先结合来实现。生腱蛋白是在脊椎动物中找到的，较大多聚体细胞外基质(ECM)糖蛋白的一个高度保守的家族。已经在哺乳动物中鉴定出四种生腱蛋白旁系同源物(paralogue)，称作生腱蛋白-C，生腱蛋白-R，生腱蛋白-X和生腱蛋白-W。生腱蛋白家族蛋白质具有共同的一级结构，其包含N端七段重复，表皮生长因子(EGF)样重复，纤连蛋白III型域重复和C端纤连蛋白样球状域。经由N段寡聚化域，亚基个体装配成三聚体，或在TnC的情况中，装配成六聚体。确实，TnC的寡聚化域据报告在与相应TNF受体配体融合时改善CD27L，CD40L，41BBL，和糖皮质激素诱导的TNF受体配体的三聚化(见Wyzgoletal.,JImmunol.183(3),1851-61(2009)及Bergetal本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与生腱蛋白‑C(TnC)特异性结合的抗原结合模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子的特征在于，该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，且在于该第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.11 EP 16169244.71.一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与生腱蛋白-C(TnC)特异性结合的抗原结合模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子的特征在于，该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，且在于该第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。2.权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其进一步包含(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。3.权利要求1或2的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与TnC特异性结合的模块，和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其中该抗原结合分子的特征在于，(i)该第一多肽含有CH1或CL域，且该第二多肽含有相应的CL或CH1域，其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接，且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者(ii)该第一多肽含有CH3域，且该第二多肽含有相应的CH3域，且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，且其中该第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者(iii)该第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域，且该第二多肽含有相应的VL-CH1域或VH-CL域，其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接，且其中该第一多肽包含通过肽接头与VH或VL且彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。4.权利要求1至3任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该TNF配体家族成员共刺激人T细胞激活。5.权利要求1至4任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。6.权利要求1至5任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该TNF配体家族成员是4-1BBL。7.权利要求1至6任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：(a)至少一个能够与TnC特异性结合的抗原结合模块，和(b)含有CH1或CL域的第一多肽和含有相应的CL或CH1域的第二多肽，其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接，且其中该抗原结合分子的特征在于，该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，且在于该第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。8.权利要求1至7任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够与TnC特异性结合的模块选自由抗体片段，Fab分子，交换Fab分子，单链Fab分子，Fv分子，scFv分子，单域抗体，aVH和支架抗原结合蛋白组成的组。9.权利要求1至8任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该分子包含一个或两个能够与TnC特异性结合的模块。10.权利要求1至9任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够与TnC特异性结合的抗原结合模块是能够与TnC特异性结合的Fab分子。11.权利要求1至10任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够与TnC特异性结合的抗原结合模块包含VH域和VL域，该VH域包含(i)包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQIDNO:68的氨基酸序列的CDR-H2，和(ii...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·阿曼，P·布鲁恩克，C·克劳斯，C·费拉拉科勒，S·格劳理查兹，C·克雷恩，V·列维茨基，E·莫斯纳，P·尤马纳，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH