本发明专利技术涉及一种竞争性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽，属于生物医药技术领域；本发明专利技术以表皮细胞生长因子受体的胞外域EGFR‑ECD为靶分子，经噬菌体展示技术的淘选，以EGF为有效成分特异性洗脱结合靶分子的噬菌体，得到生物活性多肽TUZG14；经本发明专利技术证实，该生物活性多肽TUZG14显著抑制了由EGF引起的胃癌细胞的增殖过程；本发明专利技术多肽序列较短，易于合成和实现规模化生产，能抑制EGF的促癌作用，具备后续开发成为抗癌药物的潜力，在抗癌药物研发方面具有重要应用价值。
Polypeptide Specifically Binding EGFR Inhibits the Proliferation of Tumor Cells Induced by EGF
The present invention relates to a competitive polypeptide binding EGFR to inhibit the proliferation of EGF-induced cancer cells, belonging to the field of biomedical technology. The polypeptide TUZG14 is obtained by using the extracellular domain EGFR ECD of epidermal growth factor receptor as the target molecule, screening by phage display technology, and specific elution of the binding target molecule with EGF as the effective component. The bioactive polypeptide TUZG14 significantly inhibits the proliferation process of gastric cancer cells induced by EGF; the polypeptide sequence of the invention is short, easy to synthesize and realize large-scale production, can inhibit the cancer-promoting effect of EGF, has the potential of subsequent development into anticancer drugs, and has important application value in the research and development of anticancer drugs.
【技术实现步骤摘要】
特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽
本专利技术属于生物医药
，涉及一种特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽。
技术介绍
表皮生长因子受体EGFR（EpidermalGrowthFactorReceptor）属于型表皮生长因子家族（即ErbB家族）。EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，它由1186个氨基酸残基组成，分子量为170KD，具有酪氨酸激酶活性。EGFR在结构上可分为三个部分：①胞外区：621个氨基酸残基，与其配体结合的区域；②跨膜区：23个氨基酸残基构成α螺旋结构，将受体固定于细胞膜上；③胞内区：542个氨基酸残基，含有典型的ATP结合位点和酪氨酸激酶磷酸化位点，负责下游通路的激活。在无配体结合状态下，EGFR以单体的形式存在于细胞膜表面，当它的胞外区与配体结合时，EGFR会形成同源或异源二聚体，EGFR的酪氨酸激酶磷酸化位点被激活并发生自磷酸化，磷酸化的酪氨酸锚定位点可以激活下游相关蛋白，为细胞提供分裂信号，刺激细胞生长、增殖。表皮生长因子（EGF）为表皮生长因子超家族的主要成员之一，是一种单链低分子量多肽，链内含53个氨基酸残基，3对二硫键，分子量为6045Da，等电点PI4.6，对热稳定，是目前已知的最稳定的蛋白质之一。EGF是一种多效应的细胞因子，EGF能够促进细胞增殖、刺激细胞分化，其主要功能是调节表皮细胞、上皮组织及间质的分化增殖。EGF通过与其细胞膜上的特异性受体EGFR相结合起到刺激细胞生长的作用。正常生理条件下，EGF与EGFR的结合对于调节正常细胞的增殖、生长和分化是必需的，但若EGF与EGFR介导的信号通路出现异常，都会使细胞的生长、分裂、分化从受控状态转变为失控状态，导致肿瘤的发生。研究表明，EGFR在许多癌症中存在高表达，如非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结直肠癌等，所以EGFR是肿瘤治疗中一个十分重要的靶点。大量研究表明，EGFR与胃癌组织的分化程度相关，EGFR的表达率越高表明肿瘤的恶性程度越高。胃癌的病情进展缓慢但持续发展，大多数胃癌患者在最初诊断时已有大量的转移性扩散，这也是胃癌预后不佳的一个主要原因，有研究表明，EGF能够促进胃癌细胞发生上皮-间质转化，有助于肿瘤细胞浸润和转移。EGF及EGFR的表达与胃癌的分化程度、浸润和转移密切相关，是胃癌治疗的理想靶点。靶向EGFR家族的药物包括两大类：抗体类药物和小分子酪氨酸激酶抑制剂。目前在我国已上市的EGFR抗体类药物有西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗等，虽然这些药物疗效显著、副作用较少，但它们的价格都十分昂贵，患者无法长期负担高额费用，使其应用也受到了限制。小分子抑制剂的作用机制与单克隆抗体不同，主要通过竞争性结合EGFR胞内段酪氨酸激酶的磷酸化位点，阻断其与ATP的相互作用，继而抑制EGFR的酪氨酸磷酸化及下游一系列的信号传导，因此小分子抑制剂在特异性方面不如单克隆抗体，且患者在使用过程中会出现腹泻、皮疹、恶心等副作用。近年来，多肽药物已经成为药物研发的热点。多肽药物分子量小，易于穿越人体屏障，其质量控制水平接近于传统的小分子化学药物，而活性接近于抗体类药物，结合了传统小分子化学药物和蛋白质药物的优势，且生产过程中排放的废物少，属于绿色制药范畴，具备广阔的开发前景。噬菌体展示技术将外源多肽的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合，使随机多肽表达于噬菌体表面，构成了一个肽库，在淘选过程中，某些与靶分子能够特异性结合的噬菌体被保留下来，从而测序得到噬菌体表面的多肽序列。噬菌体展示技术具有较强的目的性，可实现高通量的淘选，多肽易于生产且成本不高，现已广泛应用于生物医药研究的多个领域，尤其在人工抗体和疫苗研制、多肽药物的开发等方面具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型的EGFR靶向多肽，具体提供一种由噬菌体展示技术筛选得到的以EGFR为靶点的具有抗肿瘤活性的多肽。本专利技术提供一种抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽，所述多肽为TUZG14，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，具体序列信息为：LysValTrpValValProAsn。其中，所述多肽通过特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞的增殖；优选的，所述肿瘤细胞为胃癌细胞；优选的，所述胃癌细胞为AGS细胞。本专利技术还提供所述抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽在制备治疗肿瘤靶向药物中的应用。其中，优选的，所述肿瘤为胃癌。本专利技术还提供一种用于治疗或预防肿瘤的靶向药物，所述药物包括权利要求1所述的多肽；优选的，所述肿瘤为胃癌。本专利技术首先将靶标EGFR胞外域（EGFR-ECD）的基因导入了原核表达载体pET-30a中，使带有载体上标签的重组蛋白EGFR-ECD大量表达，并从包涵体中纯化得到高纯度的目的蛋白EGFR-ECD。将EGFR-ECD包被固定，使噬菌体与之结合，以EGFR的配体EGF竞争洗脱特异性结合靶分子的噬菌体，经过3轮淘选，富集得到具有高亲和力的噬菌体。将淘选到的单克隆噬菌体扩增后提取DNA，对其进行测序，并合成了出现频率较高的多肽TUZG14。经MTT法对多肽进行体外活性的验证，结果表明多肽TUZG14对EGF促进胃癌细胞AGS的增殖具有抑制作用，其氨基酸序列为：LysValTrpValValProAsn。本专利技术的有益效果：本专利技术是以EGFR为靶标筛选得到的能够特异性结合EGFR并抑制EGF促进肿瘤细胞增殖的多肽TUZG14。本专利技术中以胃癌细胞为模型，验证了多肽TUZG14具有显著抑制EGF促进肿瘤细胞生长的活性，使之具有成为抗肿瘤药物的临床价值。本专利技术的多肽序列短、分子量小，易于实现规模化生产，且生产成本不高，具有广阔的市场前景。附图说明图1为原核表达蛋白EGFR-ECD的氨基酸序列；其中阴影部分为(His)6标签，下划线部分为目的蛋白EGFR-ECD的氨基酸序列。图2为构建的蛋白表达载体pET-30a/EGFR-ECD的凝胶电泳验证结果；其中图A为1%琼脂糖凝胶验证EGFR-ECD的PCR扩增产物；图B为重组质粒pET-30a/EGFR-ECD的双酶切验证，其中M为DNA标记，1为pET-30a空载体的BamH、EcoR的双酶切结果，2为EGFR-ECD的BamH、EcoR的双酶切结果，3为EGFR-ECD的PCR扩增产物。图3为重组蛋白EGFR-ECD在BL21(DE3)中的表达及纯化验证结果；其中图A为超声破碎后未离心的菌液，其中M是蛋白标记，1为转化pET-30a空载体的转化子，2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子；图B为超声破碎并离心后的上清液，其中M是蛋白标记，1为转化pET-30a空载体的转化子，2为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子；图C为蛋白透析复性结果，1为转化pET-30a/EGFR-ECD重组载体的转化子超声破碎后未离心的菌液，2为离心后沉淀经变性及透析复性后蛋白样品条带。图4为EGF敏感性胃癌细胞株的筛选结果；其中图A为EGF对BGC-803细胞存活率的影响；B为EGF对MGC-803细胞存活率的影响；C为EGF对AGS细胞存活率的影响。图5为多肽TUZG14的活性验证结果；EGF的浓度为0.033µg/mL（5nM），TUZG14的浓度分本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽，其特征在于，所述多肽氨基酸序列为：Lys Val Trp Val Val Pro Asn。
【技术特征摘要】
1.一种抑制EGF促肿瘤细胞增殖的多肽，其特征在于，所述多肽氨基酸序列为：LysValTrpValValProAsn。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽通过特异性结合EGFR抑制EGF促肿瘤细胞的增殖。3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述肿瘤细胞为胃癌细胞。4.根据权利要求3所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：屠志刚，沈明香，卢子文，刘晗青，张雅菲，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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