一种用于检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒，属于生物检测技术领域，该试剂盒包含试剂R1和试剂R2，试剂R1包含以下浓度的组分：缓冲液50～300mmoL/L、无机盐5～50g/L、促聚剂1～20g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R2包含以下浓度的组分：缓冲液50～300mmoL/L、稳定剂10～160g/L、表面活性剂10～200g/L、封闭剂5～50g/L、包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒0.04～0.20g/L、防腐剂0.05～2g/L；稳定剂至少为甘油、蔗糖、海藻糖、乙二胺四乙酸二钠中的一种。本发明专利技术试剂盒具有灵敏度高、精密度高、试剂稳定等优点。

A Kit for Detecting Lipoprotein Phospholipase A2

The invention discloses a kit for detecting lipoprotein phospholipase A2, which belongs to the field of biological detection technology. The kit contains reagent R1 and reagent R2. Reagent R1 contains components of the following concentration: buffer 50-300 mmoL/L, inorganic salt 5-50 g/L, polymer promoter 1-20 g/L, preservative 0.05-2 g/L, and reagent R2 contains components of the following concentration: buffer 50-300 mmoL/L, stabilizer 10. Latex particles coated with anti-lipoprotein phospholipase A2 antibody were 0.04-0.20 g/L and preservatives were 0.05-2 g/L. The stabilizer was at least one of glycerol, sucrose, trehalose and disodium ethylenediamine tetraacetate. The kit has the advantages of high sensitivity, high precision and stable reagent.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒
本专利技术属于生物检测
，尤其涉及一种用于检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒。
技术介绍
脂蛋白磷脂酶A2(lipoprotein-associatedphospholipaseA2，Lp-PLA2)又称为血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)，是磷脂酶超家族中独特的一组，具有明显的底物选择性和不需要Ca2+维持其活性的特点，其受生理变异很小，基本不受体位改变和日常活动的影响。Lp-PLA2由血管内膜中的巨噬细胞、T细胞和肥大细胞分泌，并受炎性介质的调节。Lp-PLA2可水解氧化低密度脂蛋白ox-LDL中的氧化磷脂，生成脂类促炎物质(如溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸)，进而产生多种致动脉粥样硬化(如内皮细胞死亡、内皮功能异常，刺激粘附因子和细胞因子的产生)。因此，Lp-PLA2具有很强的促炎症和促动脉粥样化的作用，是一种新的血管炎症高特异性标志物，是冠心病和缺血性卒中的独立危险因素。目前现有技术中，Lp-PLA2的检测方法包括酶活力测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫分析试纸条检测和胶乳免疫比浊法等。在酶活力测定中，其是根据酶促反应原理，测定血清中Lp-PLA2的活力，该方法易受底物浓度、反应温度、pH、时间等多种因素的干扰；在酶联免疫吸附测定中，其检测灵敏度高但操作过程略显复杂，测定时间较长，影响因素多，且不适合急诊样本的检测；在免疫分析试纸条测定中，其主要采用胶体金免疫层析法或荧光免疫层析法的原理，操作简单、方便快捷，但灵敏度较低，准确性低易出现漏检情况，且自动化程度不高且不利于大批量临床检测。随着检测技术的快速发展，Lp-PLA2已实现了全自动化检测，Lp-PLA2检测试剂盒被开发并得到广泛的应用。现有以胶乳免疫比浊法制备的试剂盒存在一些不足：稳定性较差、灵敏度差。因此，有必要设计出一种新型的检测试剂盒，该试剂盒检测的稳定性较好、灵敏度高。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种用于检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒，其具有稳定性较好、灵敏度高的优点。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种用于检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒，其包含试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包含以下浓度的组分：缓冲液50～300mmoL/L、无机盐5～50g/L、促聚剂1～20g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；所述试剂R2包含以下浓度的组分：缓冲液50～300mmoL/L、稳定剂10～160g/L、表面活性剂10～200g/L、封闭剂5～50g/L、包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒0.04～0.20g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度；所述稳定剂至少为甘油、蔗糖、海藻糖、乙二胺四乙酸二钠中的一种。在本专利技术的试剂R2中加入稳定剂，当稳定剂为甘油、蔗糖、海藻糖或乙二胺四乙酸二钠时，可以提高样本检测的稳定性和灵敏度；适量的稳定剂可以在取得较好的效果前提下减少稳定剂的用量。试剂R1中添加适量的促聚剂，避免了因聚合物过多造成的非特异性反应和因聚合物太少导致的灵敏度过低，合适的聚合物用量有利于提高灵敏度和特异性。试剂R2中添加适量的表面活性剂，有效提高了检测的精密度。作为上述技术方案的改进，所述稳定剂为海藻糖和乙二胺四乙酸二钠的混合物。本专利技术试剂盒以海藻糖和乙二胺四乙酸二钠的混合物作为稳定剂，相对于单一剂型的稳定剂而言，更能增加试剂的稳定性，延长试剂盒的使用时间。作为上述技术方案的改进，在试剂R1中，所述缓冲液至少为MES-NaOH缓冲液(MES，吗啉乙磺酸)、MOPS-NaOH缓冲液(MOPS，3-(N-吗啉基)、HEPPS-NaOH缓冲液(HEPPS，4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种，所述无机盐至少为氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵中的一种，所述促聚剂至少为聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇12000中的一种，所述防腐剂至少为叠氮钠、Proclin-300、硫柳汞中的一种；在试剂R2中，所述缓冲液至少为MES-NaOH缓冲液、MOPS-NaOH缓冲液、HEPPS-NaOH缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种，所述表面活性剂至少为曲拉通X-100、吐温20、司盘40中的一种，所述封闭剂至少为牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白中的一种，所述防腐剂至少为叠氮钠、Proclin-300、硫柳汞中的一种。作为上述技术方案的改进，所述包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒是由聚苯乙烯胶乳微球进行制备，所述聚苯乙烯胶乳微球的粒径是相同的，聚苯乙烯胶乳微球的粒径为80～200nm。作为上述技术方案的进一步改进，所述包被抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒是通过以下方法进行制备：S1)取聚苯乙烯胶乳微球溶液，用磷酸盐缓冲液稀释；S2)加入N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化聚苯乙烯胶乳微球，搅拌均匀后孵育；S3)再加入磷酸盐缓冲液，室温下搅拌；S4)加入抗脂蛋白磷脂酶A2抗体后，进行孵育；抗脂蛋白磷脂酶A2抗体与聚苯乙烯胶乳微球的质量比为0.001～0.2；S5)加入终止液终止反应，室温下搅拌后保存备用；所述终止液是含有质量体积浓度为20％BSA的磷酸盐缓冲液。作为上述技术方案的更进一步改进，聚苯乙烯胶乳微球的粒径为120nm，聚苯乙烯胶乳微球溶液中聚苯乙烯胶乳微球的质量百分数为10％，所述抗脂蛋白磷脂酶A2抗体为鼠抗人脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体，抗脂蛋白磷脂酶A2抗体与聚苯乙烯胶乳微球的质量比为0.15。现有胶乳免疫比浊法，采用化学偶联法将特异性抗体结合于多种粒径组合的复合胶乳上，虽可兼顾检测灵敏度和线性范围，但胶乳试剂制备操作繁琐，易导致复合胶乳重复性差、稳定性差等；且胶乳试剂制备过程中，多采用超声波处理技术及离心与重悬，操作繁琐，制备时间较长，试剂均一性和稳定性较难控制。鉴于此，本专利技术采用化学交联法将特异性抗体结合于单一粒径的胶乳颗粒表面，避免了多种粒径组合的复合胶乳的重复性差及操作繁琐，同时兼顾了检测灵敏度和线性范围，通过特定的制备方法以及添加多种表面活性剂、稳定剂、促聚剂等优化反应体系，无需多次超声、离心和重悬即可获得稳定的胶乳试剂。活化后的聚苯乙烯胶乳微球表面的羧基与鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体序列中的氨基进行化学交联，而形成交联有Lp-PLA2抗体的聚苯乙烯胶乳微球颗粒。当样本中的Lp-PLA2与聚苯乙烯胶乳颗粒表面的Lp-PLA2抗体反应时，在促聚剂的作用下，聚苯乙烯胶乳微球颗粒迅速聚集产生一定的浊度，放大了检测信号，显著提高了测定试剂的灵敏度，可适用于各类全自动生化分析仪进行分析。本专利技术试剂盒在具备稳定性的前提下，还具有以下优点：检测时间短、灵敏度高、特异性强、精密度好、成本较低，可以实现对Lp-PLA2的准确检测。作为上述技术方案的改进，所述试剂R1由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液125mmoL/L、氯化钠35g/L、聚乙二醇120008g/L、叠氮钠0.5g/L；所述试剂R2由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液125m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒，其特征在于，包含试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包含以下浓度的组分：缓冲液50～300mmoL/L、无机盐5～50g/L、促聚剂1～20g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；所述试剂R2包含以下浓度的组分：缓冲液50～300mmoL/L、稳定剂10～160g/L、表面活性剂10～200g/L、封闭剂5～50g/L、包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒0.04～0.20g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度；所述稳定剂至少为甘油、蔗糖、海藻糖、乙二胺四乙酸二钠中的一种。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒，其特征在于，包含试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包含以下浓度的组分：缓冲液50～300mmoL/L、无机盐5～50g/L、促聚剂1～20g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；所述试剂R2包含以下浓度的组分：缓冲液50～300mmoL/L、稳定剂10～160g/L、表面活性剂10～200g/L、封闭剂5～50g/L、包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒0.04～0.20g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度；所述稳定剂至少为甘油、蔗糖、海藻糖、乙二胺四乙酸二钠中的一种。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为海藻糖和乙二胺四乙酸二钠的混合物。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在试剂R1中，所述缓冲液至少为MES-NaOH缓冲液、MOPS-NaOH缓冲液、HEPPS-NaOH缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种，所述无机盐至少为氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵中的一种，所述促聚剂至少为聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇12000中的一种，所述防腐剂至少为叠氮钠、Proclin-300、硫柳汞中的一种；在试剂R2中，所述缓冲液至少为MES-NaOH缓冲液、MOPS-NaOH缓冲液、HEPPS-NaOH缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种，所述表面活性剂至少为曲拉通X-100、吐温20、司盘40中的一种，所述封闭剂至少为牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白中的一种，所述防腐剂至少为叠氮钠、Proclin-300、硫柳汞中的一种。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒是由聚苯乙烯胶乳微球进行制备，所述聚苯乙烯胶乳微球的粒径是相同的，聚苯乙烯胶乳微球的粒径为80～200nm。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的胶乳颗粒是通过以下方法进行制备：S1)取聚苯乙烯胶乳微球溶液，用磷酸盐缓冲液稀释；S2)加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光华，杨玉军，刘秋明，许翠，
申请(专利权)人：广州市伊川生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44