一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂制造技术

本发明专利技术涉及水体治理领域，公开了一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂。该试剂以光色素叶绿素锌酸为喹诺酮类抗生素检测探针，可高效定位喹诺酮类抗生素，提高针对喹诺酮类抗生素特异性降解的效率。试剂释放的蛋白液可有效针对喹诺酮类抗生素的苯环结构进行降解，将喹诺酮类抗生素降解为醛、醇等物质，从而针对性的降解和消除喹诺酮类抗生素。叶绿素锌酸为新型光降解催化剂，与微藻蛋白液配合，在自然光的照射下就能高效的催化喹诺酮类抗生素降解为小分子的醛和醇，不仅催化效率高，而且对环境友好。本发明专利技术的试剂在实际环境修复的操作中，对喹诺酮类抗生素的降解更为彻底，且具有低毒、作用条件温和的优点，更利于实际环境的修复。

【技术实现步骤摘要】
一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂
本专利技术涉及水体治理领域，尤其涉及一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂。
技术介绍
抗生素中喹诺酮类抗菌药物具有抗菌谱广、杀菌力强、与其他抗生素之间无交叉耐药性等特点,被广泛应用海水养殖业中，但由于误用、滥用抗生素以及管理处置不当，大量的抗生素最终进入到水体中，不可避免造成了养殖水体的抗生素污染，势必会对水生生态系统造成影响。在水产养殖中，大多数使用的喹诺酮类抗生素未被动物体吸收或代谢而是直接以原形被排出，未被利用的会在底泥中蓄积或随水体扩散。氟喹诺酮类药物在海水养殖渔场底泥中半衰期达到300天，并且在附近捕捉的野生鱼体内也检测出这类药物。喹诺酮类抗生素化学性质稳定，进入环境后降解速度较慢.该类抗生素被频繁使用并进入环境水体中，进而对人体健康以及整个生态系统构成长期潜在危害，导致其产生的水体环境及其生态毒理效应已成为我国乃至全世界所面临的重大环境之一。因此，对水产养殖环境中喹诺酮的去除进行研究具有非常重要的意义。喹诺酮类抗生素的去除技术有物理、化学和生物三大类技术。。物理法由于成本高，去除不彻底，化学方法易对生态造成破坏，同时易产生二次污染，生物方法相比与前两者，环境友好且成本低，已经在水产养殖废水处理中得到广泛应用。生物方法中起关键作用的主要是微生物降解。已发表的微生物处理喹诺酮类抗生素的相关资料表明，由于喹诺酮类抗生素具有复杂的结构，故其降解效率普遍不高，且相关微生物在针对喹诺酮类抗生素的降解时也有一定的局限性，即多数情况下，一种微生物只能特定降解一种喹诺酮类抗生素。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂。该试剂能够特异性的将喹诺酮类抗生素降解为醛、酮等物质，降解彻底，且试剂制备方法简单，对环境无污染。本专利技术的具体技术方案为：一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂，包括：微藻蛋白液和叶绿素锌酸粉末。作为优选，所述能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂中含有表面活性剂和稳定剂。所述表面活性剂为烷基硫酸钠、烷基苯磺酸钠、烷基磺酸钠、脂肪酸钠中的至少一种。所述稳定剂为10～12％甘油、2.0～2.3mMEDTA、0.5～0.6mMDTT的混合液，稳定剂的pH为7.6～7.8。目前降解喹诺酮类抗生素多采用微生物菌株或利用光催化剂二氧化钛进行降解，然而，一般一种菌只能降解一种喹诺酮类抗生素，对喹诺酮类抗生素的整体降解效果较差；而二氧化钛需在紫外光下进行降解，在可见光下对喹诺酮类抗生素的降解效果较差。本专利技术的能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂，首次将叶绿素锌酸作为降解喹诺酮类抗生素的催化剂，并取得了良好的催化效果。本专利技术以光色素叶绿素锌酸为喹诺酮类抗生素检测探针，可高效定位喹诺酮类抗生素，提高针对喹诺酮类抗生素特异性降解的效率。试剂释放的蛋白液中的酶可有效针对喹诺酮类抗生素的苯环结构进行降解，将喹诺酮类抗生素降解为醛、醇等物质，从而针对性的降解和消除喹诺酮类抗生素。作为类叶绿素光催化剂，锌离子不能有效的传递电子，叶绿素锌酸的光催化活性并不高。然而，本专利技术人经过大量实验发现，当叶绿素锌酸与微藻蛋白液中的酶一同降解喹诺酮时，却具有相当好的催化效果。叶绿素锌酸能通过氢键与喹诺酮类抗生素连接，定位喹诺酮类抗生素，同时，叶绿素锌酸中二价的锌离子能诱导酶分子折叠，使酶分子从无序状态折叠成特定的构型，该构型能增强酶分子降解喹诺酮类抗生素的能力。叶绿素锌酸为新型光降解催化剂，与微藻的蛋白液中的酶协同，在自然光的照射下就能高效的催化喹诺酮类抗生素降解为小分子的醛和醇，不仅催化效率高，而且对环境友好无污染。用于提取蛋白液的微藻易从环境中获得，且其培养方式简单，便于繁殖，成本低廉。表面活性剂能够防止叶绿素锌酸的团聚，有利于叶绿素锌酸在水体中的分散。在喹诺酮类抗生素的水溶液中，叶绿素锌酸和微藻的蛋白液中的酶互相配合能高效的降解喹诺酮类抗生素。然而，本专利技术人在实验过程中发现，当将叶绿素锌酸和微藻的蛋白液应用于鱼塘、河水、湖水或海水等实际水体时，实际水体中的金属离子可能会影响叶绿素锌酸和微藻蛋白液中的酶的降解效果。对于这个问题，本领域的技术人员还未注意到这一点。因此，专利技术人在试剂中加入了EDTA作为金属螯合剂，用来去除金属离子，确保蛋白液中的酶不被金属离子沉降，DTT用于防止蛋白质中的半胱氨酸之间形成二硫键。甘油用来作为蛋白液中的酶的保护剂(甘油的作用)。本专利技术的试剂在实际环境修复的操作中，对污染物的降解更为彻底，且具有低毒、作用条件温和的优点，更利于实际环境的修复。一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂的制备方法如下：(1)叶绿素锌酸的合成：微藻的藻体破碎后用丙酮萃取，得叶绿素，用NaOH溶液皂化，加入盐酸溶液调pH，然后加入硫酸锌溶液进行取代，溶液有叶绿素锌酸析出，过滤并洗涤。(2)叶绿素锌酸的一次纯化：过滤反应液，将滤液置于分液漏斗中，加入二氯甲烷反复萃取至萃取液为无色，然后对萃取液进行蒸发浓缩，得浓缩液。(3)叶绿素锌酸的二次纯化：对浓缩液做薄层层析分离，通过凝胶成像仪观察荧光；用柱层析分离浓缩液，柱层析的固定相为硅胶，流动相为正丁醇、甲醇及蒸馏水，层析后得到叶绿素锌酸的溶液，经蒸发浓缩、干燥后得到浅黄色叶绿素锌酸固体。(4)小球藻蛋白液的提取：将微藻离心浓缩，然后用超声破碎仪进行破碎，离心，取上清液即为粗蛋白液。(5)蛋白液的纯化：将粗蛋白液置于饱和硫酸铵溶液中，经层析柱纯化，用氯化钠缓冲液梯度洗脱；合并具有酶活的洗脱液，用磷酸缓冲溶液透析过夜，得纯化后的蛋白液。(6)试剂的复配：在蛋白液中加入表面活性剂和叶绿素锌酸粉末，搅拌均匀后静置，加入稳定剂，即得能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂。本专利技术的能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂的制备方法操作简单，绿色无污染，对环境友好。本专利技术通过步骤(1)制备叶绿素锌酸，然后通过步骤(2)和(3)进行纯化，二氯甲烷作为萃取剂，毒性相对较低，萃取效果较好。然后再利用柱层析进行分离，纯化效果高，得到的叶绿素锌酸的纯度高。通过步骤(4)提取微藻的蛋白液，利用层析柱，通过氯化钠缓冲液梯度洗脱进行纯化。以氯化钠缓冲液梯度洗脱，不仅分离精度高，效率较高，而且不会引入新的污染物。最后，将得到的叶绿素锌酸和微藻蛋白液进行复配，加入十二烷基硫酸钠作为表面活性剂，静置后加入稳定剂。作为优选，步骤(1)中，所述NaOH溶液的摩尔浓度为0.5～2mol/L，在60～80℃条件下皂化1～2h，用摩尔浓度为1～3mol/L的盐酸溶液调pH至2～3，硫酸锌溶液的质量浓度为4～6g/L，在温度为50～90℃条件下取代1～2h。用氢氧化钠对叶绿素进行皂化得到叶绿素钠盐，加入盐酸调节pH后，用硫酸锌取代一段时间得到叶绿素锌酸。作为优选，步骤(3)中，所述流动相正丁醇、甲醇、蒸馏水的重量比为6～8:3～5:1。根据叶绿素锌酸与杂质在固定相和流动相中分配系数不同进行柱层析分离，当流动相为重量比为6～8:3～5:1的正丁醇、甲醇、蒸馏水的混合溶液时，叶绿素锌酸与其他杂质的分离提纯效果最好。经过两次分离纯化后叶绿素锌酸的含量得到大大的提高。作为优选，步骤(4)中，所述小球藻在2～4℃、6000～8000r/min的条件下离心8～10min，细胞破碎仪的功率本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂，其特征在于包括：微藻蛋白液和叶绿素锌酸粉末。

【技术特征摘要】
1.一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂，其特征在于包括：微藻蛋白液和叶绿素锌酸粉末。2.如权利要求1所述的一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂，其特征在于：所述试剂中含有表面活性剂和稳定剂。3.如权利要求1或2所述的一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂，其特征在于：所述表面活性剂为烷基硫酸钠、烷基苯磺酸钠、烷基磺酸钠、脂肪酸钠中的至少一种。4.如权利要求1或2所述的一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂，其特征在于：所述稳定剂为10~12%甘油、2.0~2.3mMEDTA、0.5~0.6mMDTT的混合液，稳定剂的pH为7.6~7.8。5.如权利要求1所述的一种能特异性降解喹诺酮类抗生素的试剂，其特征在于所述试剂的制备方法如下：（1）叶绿素锌酸的合成：微藻的藻体破碎后用丙酮萃取，得叶绿素，用NaOH溶液皂化，加入盐酸溶液调pH，然后加入硫酸锌溶液进行取代，溶液有叶绿素锌酸析出，过滤并洗涤；（2）叶绿素锌酸的一次纯化：过滤反应液，将滤液置于分液漏斗中，加入二氯甲烷反复萃取至萃取液为无色，然后对萃取液进行蒸发浓缩，得浓缩液；（3）叶绿素锌酸的二次纯化：对浓缩液做薄层层析分离，通过凝胶成像仪观察荧光；用柱层析分离浓缩液，柱层析的固定相为硅胶，流动相为正丁醇、甲醇及蒸馏水，层析后得到叶绿素锌酸的溶液，经蒸发浓缩、干燥后得到浅黄色叶绿素锌酸固体；（4）小球藻蛋白液的提取：将微藻离心浓缩，然后用超声破碎仪进行破碎，离心，取上清液即为粗蛋白液；（5）蛋白液的纯化：将粗蛋白液置于饱和硫酸铵溶液中，经层析柱纯化，用氯化钠缓冲液梯度洗脱；合并具有酶活的洗脱液，用磷酸缓冲溶液透析过夜，得纯化后的蛋白液；...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈庆国，刘梅，鲍博，李晶晶，戚柳倩，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33