变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶及龙涎香醇的制备方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种可简便地得到龙涎香醇的龙涎香醇的制备方法。可利用作为DXDD模体的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的四异戊烯基‑β‑姜黄烯环化酶解决所述技术问题，该环化酶：(a)以所述DXDD模体为基准，在N末端侧具有QXXXGX(W/F)模体及QXXXX(G/A)X(F/W/Y)模体，在C末端侧具有QXXXGX(F/W/Y)模体、QXXXGXW模体及QXXXGX(F/W)模体，且在距离C末端侧170个氨基酸残基以上的位置上不具有QXXXGXW模体，(b)与序列号1或13所表示的氨基酸序列的同一性为40％以上，且(c)将角鲨烯作为基质并表现出龙涎香醇生成活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶及龙涎香醇的制备方法
技术介绍
龙涎香(ambergris)是一种7世纪开始在世界各地得到使用的高级香料，也被用作中药。龙涎香被认为是抹香鲸利用消化管分泌物将食物(章鱼、乌贼等)的不消化物结石化并排泄出的物质，但详细的生成机制尚不明确。龙涎香的主要成分为龙涎香醇，认为龙涎香在漂浮在海上的期间因阳光和氧而受到氧化分解，生成具有各种香气的化合物。作为龙涎香的主要成分的龙涎香醇被用作香料或药剂，但无法从自然界中大量获得。因此，人们提出了各种有机合成方法。例如，在专利文献1中公开了一种简便廉价且效率良好地制备(+)-龙涎香醇的方法，该方法包括由龙涎香内酯(ambreinolide)制备新的磺酸衍生物，并使其与γ-环香叶基卤化物的光学活性体进行偶联的工序。此外，在非专利文献1中公开了一种方法，其通过朱利亚(Julia)偶联反应，使由(±)(5,5,8a-三甲基八氢化-1H-螺[萘-2,2’-环氧乙烷]-1-基)甲醇合成的2-((1R,2R,4aS,8aS)-2-(甲氧基甲氧基)-2,5,5,8a-四甲基十氢化萘-1-基)乙醛与由(±)甲基6-羟基-2,2-二甲基环己烷羧酸酯合成的5-((4-((S)-2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)丁烷-2-基)磺酰基)-1-苯基-1H-四唑进行汇集合成，得到龙涎香醇。然而，由于以往的龙涎香醇的有机合成方法需要较多的合成阶段，反应体系复杂，因此尚未达成工业化。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开平10-236996号公报专利文献2：国际公开WO2015/033746号手册非专利文献非专利文献1：TetrahedronAsymmetry,(2006)Vol.17,pp.3037-3045非专利文献2：Biosci.Biotechnol.Biochem.,(1999)Vol.63,pp.2189-2198非专利文献3：Biosci.Biotechnol.Biochem.,(2001)Vol.65,pp.2233-2242非专利文献4：Biosci.Biotechnol.Biochem.,(2002)Vol.66,pp.1660-1670非专利文献5：J.Am.Chem.Soc.,(2011)Vol.133,pp.17540-17543非专利文献6：J.Am.Chem.Soc.,(2013)Vol.135,pp.18335-18338
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题另一方面，已知有通过使用角鲨烯-藿烯环化酶的变异型酶(D377C、D377N、Y420H、Y420W等)而由角鲨烯得到作为单环性三萜的3-脱氧蓍醇A(3-deoxyachilleolA)的方法(非专利文献2～4)。本申请的专利技术人发现，通过使可由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的变异型角鲨烯-藿烯环化酶与角鲨烯进行反应，得到3-脱氧蓍醇A，进一步通过使其与四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶进行反应，可制备龙涎香醇(专利文献2)。然而，专利文献2的方法为多阶段反应，且收率仍有改善的余地。因此，本专利技术的目的在于提供一种能够简便地得到龙涎香醇的龙涎香醇的制备方法。解决技术问题的技术手段本申请的专利技术人对效率良好地制备龙涎香醇的方法进行了深入研究，结果发现，存在特定变异的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶具有由角鲨烯生成龙涎香醇的活性。该由角鲨烯产生龙涎香醇是通过利用本专利技术的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A而达成的。此外，由角鲨烯产生龙涎香醇是通过利用本专利技术的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，由二环性的8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯(8α-hydroxypolypoda-13,17,21-triene)生成龙涎香醇而达成的。本专利技术的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶表现出上述酶活性，令人惊讶。本专利技术是基于上述见解而完成的。因此，本专利技术涉及：[1]一种变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，其为作为DXDD模体的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，(a)所述变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶以所述DXDD模体为基准，在距离N末端侧100个氨基酸残基以上的位置上具有QXXXGX(W/F)模体，在距离N末端侧10～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXX(G/A)X(F/W/Y)模体，在距离C末端侧20～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W/Y)模体，在距离C末端侧50～120个氨基酸残基的位置上具有QXXXGXW模体，及在距离C末端侧120～170个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W)模体，且在距离C末端侧170个氨基酸残基以上的位置上不具有QXXXGXW模体，(b)与序列号1或13所表示的氨基酸序列的同一性为40％以上，且(c)以角鲨烯为基质，表现出龙涎香醇生成活性。[2]根据[1]所述的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，其中，构成所述变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多肽为：(1)序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的多肽、或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的多肽；(2)由在下述氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列构成、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列、或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列；(3)由下述氨基酸序列构成、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：与序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列、或与序列号13所表示的氨基酸序列中中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列；(4)包含下述氨基酸序列、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列、或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列；(5)包含下述氨基酸序列、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：在序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列，或在序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或数个的氨基酸而成的氨基酸序列；或(6)包含下述氨基酸序列、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：与序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列、或与序列号13所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种变异型四异戊烯基‑β‑姜黄烯环化酶，其为作为DXDD模体的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的变异型四异戊烯基‑β‑姜黄烯环化酶，(a)所述变异型四异戊烯基‑β‑姜黄烯环化酶以所述DXDD模体为基准，在距离N末端侧100个氨基酸残基以上的位置上具有QXXXGX(W/F)模体，在距离N末端侧10～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXX(G/A)X(F/W/Y)模体，在距离C末端侧20～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W/Y)模体，在距离C末端侧50～120个氨基酸残基的位置上具有QXXXGXW模体，及在距离C末端侧120～170个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W)模体，且在距离C末端侧170个氨基酸残基以上的位置上不具有QXXXGXW模体，(b)与序列号1或13所表示的氨基酸序列的同一性为40％以上，且(c)以角鲨烯为基质，表现出龙涎香醇生成活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.04 JP 2016-0426611.一种变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，其为作为DXDD模体的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，(a)所述变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶以所述DXDD模体为基准，在距离N末端侧100个氨基酸残基以上的位置上具有QXXXGX(W/F)模体，在距离N末端侧10～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXX(G/A)X(F/W/Y)模体，在距离C末端侧20～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W/Y)模体，在距离C末端侧50～120个氨基酸残基的位置上具有QXXXGXW模体，及在距离C末端侧120～170个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W)模体，且在距离C末端侧170个氨基酸残基以上的位置上不具有QXXXGXW模体，(b)与序列号1或13所表示的氨基酸序列的同一性为40％以上，且(c)以角鲨烯为基质，表现出龙涎香醇生成活性。2.根据权利要求1所述的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，其中，构成所述变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多肽为：(1)序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的多肽，或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的多肽；(2)由在下述氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列构成、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列、或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列；(3)由下述氨基酸序列构成、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：与序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列、或与序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列；(4)包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐藤努，奥野琴音，竹花稔彦，小池诚治，
申请(专利权)人：国立大学法人新潟大学，株式会社ADEKA，
类型：发明
国别省市：日本,JP