本发明专利技术涉及一种雷公藤三萜合酶TwOSC3蛋白及其编码基因，将Twosc3基因的cDNA克隆到真核表达载体pYES2，构建带有Twosc3基因的重组表达载体，转入酵母表达宿主菌，可生产得到木栓酮。通过突变研究结果表明，Twosc3基因编码的氨基酸482为关键位点，可以提高或降低木栓酮或香树素的产量。通过基因枪介导的干扰实验表明，Twosc3基因的干扰对于雷公藤中雷公藤红素的合成有明显的抑制作用，本发明专利技术TwOSC3蛋白及其编码基因可用于生物合成植物三萜类化合物，以及培育高品质的雷公藤。
Triterpenoid synthase TwOSC3 from Tripterygium wilfordii and its coding gene and Application
The invention relates to a tripterpene synthase TwOSC3 protein of Tripterygium wilfordii and its coding gene. The Twosc3 gene is cloned into eukaryotic expression vector pYES2, and a recombinant expression vector with Twosc3 gene is constructed. The recombinant expression vector is transferred into yeast expression host bacteria, and the Corydalis ketone can be produced. The mutation results showed that amino acid 482 encoded by Twosc3 gene was the key site, which could increase or decrease the yield of phellodendrone or coumarin. The gene gun-mediated interference experiment shows that the interference of Twosc3 gene has obvious inhibition effect on the synthesis of triptolide in Tripterygium wilfordii. The TwOSC3 protein and its coding gene of the invention can be used for the biosynthesis of plant triterpenoids and the cultivation of high-quality Tripterygium wilfordii.
【技术实现步骤摘要】
雷公藤三萜合酶TwOSC3及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种雷公藤三萜合酶及其编码基因，以及该三萜合酶及其编码基因在三萜类化合物生物合成中的运用，属于药用植物基因工程领域。
技术介绍
中药雷公藤来源于药用植物雷公藤(Tripterygiumwilfordii.Hook.f.)的干燥根的木质部，被广泛用于类风湿性关节炎和炎症的治疗(RaphaelaGM,MildredW,RoyF,etal.ComparisonofTripterygiumwilfordiiHookFVersusSulfasalazineintheTreatmentofRheumatoidArthritis:ARandomizedTrial[J].AnnalsofInternalMedicine,2009,151(4):229-240.TaoXL,LipskyPE.TheChineseanti-inflammatoryandimmunosuppressiveherbalremedyTripterygiumwilfordiiHookF.[J].RheumaticDiseaseClinicsofNorthAmerica,2000,26(1):29–50.)。萜类成分为雷公藤的主要活性成分，包括雷公藤甲素(triptolide)、雷酚内酯(triptophenolide)和雷公藤红素(celastrol)等。从中药中的活性成分开发新药是一种很有潜力的方式，然而由于植物的生长缓慢，再加上这些有效成分在植物体中的含量不多，因而大大限制了它的发展。通过探寻和阐释萜类成分在雷公藤中的生物合成途径及其调控机制，有助于为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。雷公藤中以木栓烷型的雷公藤红素为代表的三萜类化合物具有抗炎、抗风湿、抗肿瘤、减肥、免疫抑制、治疗神经性疾病等活性(LiuJ,LeeJ,SalazarhernandezMA,etal.TreatmentofObesitywithCelastrol[J].Cell,2015,161(5):999–1011.)。通过胞浆的甲羟戊酸途径(mevalonicacid(MVA)pathway)和质体的2-methyl-D-erythritol-4-phosphate(MEP)途径生成萜类的通用底物异戊烯焦磷酸(Isopentenylpyrophosphate(IPP))及其异构体Dimethylallylpyrophosphate(DMAPP)。再由此分别生成单萜(monoterpenes),倍半萜(sesquiterpenes)，二萜(diterpenes)和三萜(triterpenes)的底物香叶基焦磷酸(Geranyldiphosphate(GPP)),法尼基焦磷酸(farnesyldiphosphate(FPP))和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyldiphosphate(GGPP))。三萜合酶(Triterpenesynthase)，又称三萜环化酶(Triterpenecyclase)或2,3-氧化鲨烯环化酶(2,3-oxidosqualenecyclase,OSC)，被认为是合成三萜类次生代谢终产物的关键酶，它能够催化2,3-氧化鲨烯形成三萜骨架。本专利技术从雷公藤悬浮细胞中克隆得到一条Twosc3基因，通过验证其具有催化2.3-氧化鲨烯生成木栓酮的生物学功能，而木栓酮为木栓烷型三萜(雷公藤红素、扁塑藤素等)的母核结构，木栓酮经过修饰酶如P450等基因的修饰可以生成雷公藤红素等具有显著药理活性的三萜类化合物。该基因是首次从雷公藤中得到的三萜类成分合成的关键酶基因，在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的雷公藤三萜合酶基因及其氨基酸序列。
技术实现思路
本专利技术提供了一种分离的蛋白，所述蛋白参与三萜类化合物的生物合成，尤其是木栓烷型三萜类化合物的生物合成。本专利技术中，所述分离的蛋白为一种参与雷公藤三萜类化合物的合成，尤其是雷公藤红素合成的关键酶，本文将其命名为雷公藤三萜合酶(TripterygiumwilfordiiTriterpenesynthase，TwOSC3)，所述雷公藤三萜合酶具有：(1)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列；或(2)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸且功能相同的肽。本专利技术中，TwOSC3蛋白或多肽，是指：具有三萜合酶活性(参与木栓烷型三萜类化合物的生物合成)的SEQIDNO：2序列的多肽，当然还包括具有与天然TwOSC3相同功能的SEQIDNO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。TwOSC3蛋白或多肽还包括TwOSC3的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连接于信号肽、启动子、核糖体结合位点或终止子序列组成的衍生物。TwOSC3蛋白变体或具有实质上相似的序列一致性的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入。这些改变优选在性质上较小，即保守氨基酸替代(见表1)和不显著影响多肽的折叠或活性的其它替代；小的缺失，典型地一个至约30个氨基酸的缺失；氨基或羧基端延伸，例如氨基端甲硫氨酸残基，不超过约20-25个残基的小的接头肽或亲和标签。本专利技术因此提供包含与SEQIDNO：2至少有70％，优选至少有90％、更优选95％、96％、97％、98％、99％或更多一致的序列的多肽。表1保守氨基酸替代可以确定包含对于维持结构完整性关键的区域或域的氨基酸残基。可以确定在这些区域中或多或少耐受改变而保持分子的整个三级结构的特定残基。分析序列结构的方法包括，但不限于具有高氨基酸或核苷酸一致性的多个序列的比对、二级结构倾向(propensity)、二级元图(binarypatterns)、互补堆积(complementarypacking)和隐蔽的极性相互作用(Barton,CurrentOpin.Struct.Biol.5:372-376,1995；和Cordes等，CurrentOpin.Struct.Biol.6:3-10，1996)。一般地，当设计分子修饰或鉴定特定片段时，将在确定结构的同时评价修饰的分子的活性。可以在TwOSC3蛋白中进行氨基酸序列改变以便最少破坏对生物学活性必须的高级结构。例如，当TwOSC3蛋白包含一个或多个螺旋时，将改变氨基酸残基以便不破坏螺旋的几何学和其中的构象改变将使一些关键功能(例如分子与其结合伙伴的结合)减弱的其它分子成分。氨基酸序列改变的效果可以通过例如以上公开的计算机模拟进行预测，或通过晶体结构分析进行测定(见例如Lapthorn等，Nat.Struct.Biol.2:266-268，1995)。本领域熟知的其它技术对改变蛋白和标准本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.分离的蛋白，所述蛋白为(1)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或(2)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸且功能相同的肽。
【技术特征摘要】
1.分离的蛋白，所述蛋白为(1)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列；或(2)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸且功能相同的肽。2.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述蛋白为将SEQIDNO：2所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行突变：(1)将第482位的Leu突变为Ile、Ser、Val、Phe、Pro、Arg或Ala。3.编码权利要求1或2所述蛋白的多核苷酸。4.根据权利要求3所述多核苷酸，所述多核苷酸为如下中的至少一种：(1)SEQIDNO：1第115-2406位所示的核苷酸分子；或(2)SEQIDNO：1第115-2406位所示的核苷酸分子经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列；或(3)在严谨条件下与SEQIDNO：1第115-2406位所示核苷酸分子杂交的核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：高伟，周家伟，胡添源，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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