一种还原酶及其基因、重组酶及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一类还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。本发明专利技术的还原酶或其重组酶可来源于芽孢杆菌(Bacillus?sp.)CGMCC?No.2549，可作为催化剂应用于不对称还原前手性羰基化合物以制备多种光学活性手性醇，其催化效率高、立体选择性强，且适用的反应条件温和、对环境友好。与野生型芽孢杆菌(Bacillus?sp.)CGMCC?No.2549的整细胞相比，本发明专利技术的还原酶催化效果更佳，底物适用性更广，具有很好的工业应用开发前景。

【技术实现步骤摘要】
一种还原酶及其基因、重组酶及制备方法和应用本申请为专利技术名称为“一种还原酶及其基因、重组酶及制备方法和应用”、申请号为201010527409. O、申请日为2010年10月29日的专利申请的分案申请。
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。
技术介绍
含有特定功能基团的光学活性手性醇是合成医药、农药及其它精细化学品的重要手性砌块。研究人员已开发出多种光学活性手性醇合成的方法，包括动力学拆分和不对称合成。其中，利用前手性羰基化合物的不对称还原合成光学活性手性醇的途径，可实现理论 100%的产率，是生产光学活性手性醇的重要方法。化学家们已经发现手性金属化合物可作为催化剂用于羰基的不对称还原，尽管该化学方法已被用于工业生产，然而该方法操作难度大，反应条件苛刻，且产物中可能会残留重金属，因此其应用受到限制。生物催化方法不仅反应条件温和、对环境友好，具有高度的区域选择性和立体选择性，而且避免了产物中重金属残留，恰好弥补了化学方法的不足之处，因此近几年来生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇不对称合成中的应用越来越受到重视。氧化还原酶是催化生物氧化/还原反应的一大类酶，被广泛应用于不对称合成光学活性手性药物和功能性类固醇等化合物，因此开发具有实际应用价值的氧化还原酶一直是生物
的一项重要内容。醛酮还原酶(AKR)和短链醇脱氢酶(SDR)是羰基还原酶家族的两大重要超家族。其中AKR超家族可分成15个家族，包含约150个成员。相比而言，SDR超家族成员数目较为庞大，目前已有46000多个成员。醛酮还原酶多为NADPH依赖型，通常为单亚基结构，亚基大小一般在35 40kDa左右；而短链醇脱氢酶多数由双亚基或四个亚基组成，亚基大小一般在27kDa左右。还原酶来源十分广泛，在微生物中普遍存在。例如，面包酵母全基因组中包含49个编码还原酶的开放读码框，其中18个还原酶的基因已被克隆表达并用于酮酯的不对称还原(J. Am. Chem. S°C .，2004，126 :12827-12832)。另外，从许多其它微生物中也分离得到了具有立体选择性的还原酶，有些被进一步克隆表达， 并应用于生物催化领域。例如，Kita等(J. Mol. Catal. B =Enzym.，1999，6 =305-313)从掷抱酵母(Sporobolomyces salmonicolor) AKU4429中分离得到三种可催化4-氯乙酸乙酸乙酯不对称还原的还原酶；Itoh等(Appl. Microbiol. Biotehnol. ,2004,66 :53-62)对青霉菌 (Penicillium citrinum) IF04631中的一种P -酮酯还原酶(AKR3E1)进行了异源表达,并应用于(S)-4-溴-3-羟基丁酸甲酯的生产中。然而目前应用于工业的还原酶类催化剂所占的比率尚不足总量的14%。如何针对特定的底物找到具有高催化活性和选择性的生物催化剂是该领域至关重要的问题。将生物信息学和基因重组技术相结合，快速高效地开发性能优异的新型生物催化剂，是发展生物不对称还原技术的有效途径。Yamamoto等(Appl. Microbiol. Biotechnol. , 2003,61 133-139)利用该手段克隆了来自枯草芽孢杆菌中的重组还原酶FabG以及其他多种微生物中的FabG结构类似酶，用以催化4-氯乙酰乙酸乙酯的不对称还原。另外，其它一些来自枯草芽孢杆菌的还原酶的结构和性质也已有研究报道。如枯草芽孢杆菌还原酶YtbE对多种醛类化合物有还原活性(Protein Science, 2009,18 :1792-1800);还原酶YueD对联苯甲酰有还原活性(J. Biotechnol. ,2002,96 :157-169)。但这三种来自枯草芽孢杆菌的还原酶是否可以用于催化其他羰基化合物的不对称还原，迄今尚无文献报道。目前已知芽孢杆菌(Bacillus sp. ) ECUOO13，S卩CGMCC No. 2549可催化多种芳基酮不对称还原生成光学活性手性仲醇(Bioresour. Technol.，2010，101 =1054-1059 ;专利技术专利CN101372677B)。但是以该野生菌株整细胞作为催化剂时，由于酶产量很低，导致总体催化活性不高，从而限制了生物催化剂的优势发挥。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对以野生芽孢杆菌(BaciIIus sp. ) CGMCC No. 2549整细胞作为芳基酮不对称还原催化剂时酶产量较低使总体催化活性不高，不对称还原底物谱较窄的缺陷，而提供一种具有优异的不对称催化活性、底物适用性广、对环境友好的还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该还原酶或其重组酶的应用。本专利技术通过下述技术方案以解决上述技术问题本专利技术的还原酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6所示。本专利技术以来源于芽孢杆菌(Bacillus sp. )ECU0013的辅酶依赖类型为NADPH型的该还原酶为例进行说明。本专利技术中，所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.) E⑶0013现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No. 2549。该菌株从土壤中筛选得到， 在专利技术专利(CN101372677B)中有详细说明。本专利技术还涉及一种还原酶基因，其为(I)其碱基序列如序列表中SEQ ID No. USEQ ID No. 3 或 SEQ ID No. 5 所示；或(2)其编码由序列表中 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本专利技术的还原酶基因可来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.) CGMCC No. 2549，具体制备方法可为根据Genbank中收录的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168的还原酶YtbE、FabG和YueD的基因序列设计合成引物，然后以芽孢杆菌(Bacillus sp.) CGMCC No. 2549的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得三条完整的还原酶全长基因序列，分别为喊基序列如序列表中SEQ ID No. I所不的基因，命名为BCR I，全长843bp。其中， 其编码序列(CDS)从第I个碱基起至第840个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为 TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。喊基序列如序列表中SEQ ID No. 3所不的基因，命名为BCR II，全长741bp。其中，其编码序列(CDS)从第I个碱基起至第738个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为 TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。喊基序列如序列表中SEQ ID No. 5所不的基因，命名为BCR 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许建和，倪燕，李春秀，张杰，潘江，王丽娟，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：