一种基于二代测序技术的分子标记检测方法技术

本发明专利技术属于分子标记辅助育种技术领域，公开了一种基于二代测序技术的分子标记检测方法,通过扩增子测序的原理，利用设计的多个位点的特异引物及PCR反应体系、分析流程，通过一轮多重PCR一次获取所有单株在多个重要农艺性状相关位点的扩增子，再使用含有不同标签序列的引物，对扩增子再进行一次扩增，将所有单株的扩增子加上互不相同的标签序列，对扩增子进行二代测序，通过对测序结果分析，即可一次获得所有单株的基因型。使用本发明专利技术构建的高通量检测体系，可快速、精准的检测目前在育种实践中广泛应用的抗病、品质相关基因。

【技术实现步骤摘要】
一种基于二代测序技术的分子标记检测方法
本专利技术属于分子标记辅助育种
，尤其涉及一种基于二代测序技术的分子标记检测方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：当前应用于育种工作中的分子标记是通过将控制农艺性状相关的基因内的功能性位点或者与其紧密连锁的变异位点转化为AFLP，CAPS，SSR，indel，SCAR等标记产生的。如用于检测Ty-1的双重SNP标记NL2-3(葛乃蓬etal.2014)，用于检测Tm-2a的SCAR标记ToMV(Fooladetal.2012)等。该类技术主要依赖于PCR扩增的特异性、限制性内切酶的特异性，最终通过琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目标条带的有无、大小来区分基因型。以SNP类型的标记为例，若SNP位于限制性内切酶酶切位点内，则可将其转化为CAPS标记，设计一对通用引物，将SNP所在的目标区段扩增出来，使用限制性内切酶对PCR产物进行酶切，不同基因型的材料因在SNP位点的突变与否，会产生不同的酶切带型，通过琼脂糖凝胶电泳的方式，即可区分出不同的基因型。若该SNP位点不位于酶切位点内，则可通过ASC-PCR的方式转化为分子标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，所述基于二代测序技术的分子标记检测方法包括：基于扩增子测序的原理，利用多个位点的特异引物及PCR反应体系、分析流程，通过一轮多重PCR一次获取所有单株在多个重要农艺性状相关位点的扩增子；使用含有不同标签序列的引物，对扩增子再进行一次扩增将所有单株的扩增子加上互不相同的标签序列，对扩增子进行二代测序；通过测序结果，一次获得所有单株的基因型。

【技术特征摘要】
1.一种基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，所述基于二代测序技术的分子标记检测方法包括：基于扩增子测序的原理，利用多个位点的特异引物及PCR反应体系、分析流程，通过一轮多重PCR一次获取所有单株在多个重要农艺性状相关位点的扩增子；使用含有不同标签序列的引物，对扩增子再进行一次扩增将所有单株的扩增子加上互不相同的标签序列，对扩增子进行二代测序；通过测序结果，一次获得所有单株的基因型。2.如权利要求1所述的基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，所述基于二代测序技术的分子标记检测方法具体包括：(1)农艺性状相关基因变异位点或连锁位点序列信息的收集；(2)设计多重靶位点特异引物及标签引物，获取及编码多靶位点扩增子；(3)两轮PCR反应获取扩增子；(4)上机测序及数据分析。3.如权利要求2所述的基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，步骤(1)农艺性状相关基因变异位点或连锁位点序列信息的收集，包括：1)对于已克隆到的基因，只选取已证实控制所述基因功能的关键性变异位点作为靶位点；2)对于已克隆但未证实功能性的相关位点的基因及只进行定位而未克隆的基因，仅选取与所述基因功能存在高度连锁关系的位点作为靶位点；3)对于没有证实的功能性的变异位点的已克隆的基因，同时收集多种已知基因型材料的基因序列。4.如权利要求2所述的基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，所述步骤(2)设计多重靶位点特异引物及标签引物，获取及编码多靶位点扩增子，包括：根据步骤(1)选取的靶位点和基因序列设计多重PCR引物，将扩增的目的片段长度控制在70-110bp，进行双端二代测序时，每个单向测序反应同时获取片段序列及位于片段末端的标签序列。5.如权利要求2所述的基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，所述标签引物的设计方法包括：通过随机生成两组六位长度的碱基序列形成标签；分别在两组标签的3’端加上二代测序使用的测序引物序列，在两组标签的5’端加上二代测序使用的锚定引物序列。6.如权利要求2所述的基于二代测序技术的分子标记检测方法，其特征在于，步骤(3)两轮PCR反应获取扩增子包括：将所有靶位点引物混合，利用多重PCR试剂对待测样品的DNA进行第一轮的多重PCR，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶志彪，任志勇，张俊红，张余洋，欧阳波，王涛涛，李汉霞，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42