用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA引物制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA引物，所述引物上游P1：5'‑TTAGCTTATATGGATGCTGGTGGTTCATTC‑3'，下游引物P2：5'‑TTACTTCTCAAGGACCAACTAGAGTCATTG‑3'，该RPA引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明专利技术还提供一种用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA方法，该方法包括引物合成，待测样品中DNA的提取、RPA扩增以及扩增产物分析等步骤，该检测方法操作简单，为基层兽医工作者有效检测和鉴定丝状支原体山羊亚种引起的羊支原体性肺炎提供一种快速、便捷、特异的诊断方法。

【技术实现步骤摘要】
用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA引物
本专利技术属于兽医传染病快速诊断
，具体涉及一种用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA引物及应用。
技术介绍
丝状支原体山羊亚种(Mycoplasmamycoidessubsp.capri,Mmc)是丝状支原体簇的成员之一，是羊支原体性肺炎(Mycoplasmapneumoniaofgoatsandsheep,MPGS)的病原之一。MPGS传染性强，主要通过呼吸道感染，也可垂直传播，病羊和耐过羊是该病的主要传染源(贺英等,2009;万一元等,2000)。MPGS的潜伏期平均为18-20d，最快3-6d，最长为30-40d。其临床特征主要表现为高热、咳嗽渐进性消瘦以及肺实质、小叶间质及胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，肺部有明显的肝变为主要特征的呼吸道疾病，此外还可引起乳房炎、角膜结膜炎和败血病等。该病的发病率为19%-90%，死亡率高达40%（贺英等,2009）。当前国外非洲(Kama-Kamaetal.,2016)、西班牙(Juanetal.,2016)、意大利(CoronaLetal.,2014;Gillaraetal.,2015)、美国(Algireetal.,2012)、约旦(D’Angeloetal.,2010)，国内四川(杜永凤，2008)、贵州(王慧等,2013)、内蒙古(Xuetal,2014)、青海(韩赟等,2010)、广西(陶立等,2015)、福建(江锦秀等,2016)等地均有该病发生的报道。该病给养羊业造成了严重的经济损失，因此，亟需建立一种Mmc特异、敏感、简便的检测方法。常规PCR技术以其能够检测痕量的病因DNA而一直被作为诊断多种疫病的金标方法。但是PCR需要特殊的热循环设备，不利于基层推广使用。重组聚合酶扩增（RecombinasePolymeraseAmplification,RPA）技术是由英国公司TwistDxInc开发的一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链节和蛋白和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在38℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。目前已用于食品、药品、化妆品等领域的质量控制和环境、水质等监测;医学临床诊断，代谢性疾病和遗传疾病的基因诊断。丝状支原体山羊亚种的诊断方法主要有支原体的分离鉴定、常规PCR、血清学方法和SYBRGreenIRF-PCR，然而Mo对培养基营养要求较高，且不易生长，培养周期需要很长时间；常规PCR和荧光定量PCR均需特殊仪器，血清学方法存在敏感性低、特异性差等缺点，无法及时对临床样品进行快速检测。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供一种用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA引物及应用。本专利技术的RPA引物特异性强，能够检测丝状支原体山羊亚种，为快速检测丝状支原体山羊亚种提供一种有效方法，便于兽医基层工作者使用。为实现专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA引物，其中，所述RPA引物的核苷酸序列为：引物上游P1:5'-TTAGCTTATATGGATGCTGGTGGTTCATTC-3'，下游引物P2：5'-TTACTTCTCAAGGACCAACTAGAGTCATTG-3'。扩增片段大小为364bp。利用本专利技术的引物可用于丝状支原体山羊亚种相应基因进行检测，尤其适用于基于RPA技术的检测，通过对反应时间的优化，建立一种可用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA方法。具体操作方法如下：1、引物的设计与合成引物的特异性是本实验所建立方法的重要因素。根据GenBank登录的FQ377874.1的MLC_1770基因序列，利用Oligo7软件设计引物，通过BLAST软件比对分析，初步验证其特异性。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。2、阳性标准品制备以提取的DNA为模板，取1mL丝状支原体山羊亚种培养液加入1.5mL离心管中，10000r/min离心3min，弃上清收集菌体，使用生工组织DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，作为阳性标准品备用。3反应条件的优化：采用英国TwistDxInc公司的TwistAmp®Basic试剂盒进行RPA扩增反应，所述RPA扩增反应体系为50μL：10μM上游引物和10μM下游引物各2.4μL、RehydrationBuffer29.5μL、无核酸酶纯水12.2μL、DNA模板1μL和280mM醋酸镁2.5μL。根据上述的方法，所述RPA扩增反应的加样顺序为：首先将RPA反应体系中出了醋酸镁之外的成分加入到TwistAmp®Basic试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到反应管盖子内，盖上盖子瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中，然后将反应管放入38℃恒温水浴锅中孵育10min、20min、30min、40min进行时间优化。4、特异性试验分别以丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、大肠杆菌、溶血性曼氏杆菌、金黄色葡萄球菌、莱氏无胆甾原体、山羊支原体山羊亚种、牛支原体、绵羊肺炎支原体、羊口疮病毒核酸样品为模版，采用TwistAmp®Basic试剂盒进行RPA扩增，验证合成RPA引物的特异性。所述RPA扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将RPA反应体系中出了醋酸镁之外的成分加入到TwistAmp®Basic试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到反应管盖子内，盖上盖子瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中，然后将反应管放入38℃恒温水浴锅中孵育30min。反应结束后，利用PCR纯化试剂盒回收扩增产物，然后经2%琼脂糖电泳检测。5、灵敏性试验将提取的丝状支原体山羊亚种的DNA进行10倍连续倍比稀释，分别以稀释后的不同浓度的DNA为模版进行RPA反应，以确定该引物的灵敏度。反应体系和条件同特异性试验。丝状支原体山羊亚种的DNA浓度测定结果为72ng/uL，如图2所示。本专利技术中RPA引物最低检测线为720fg/uL，表明灵敏性高。本专利技术的有益效果：（1）本专利技术设计的RPA引物特异性强，检测结果准确。（2）本专利技术建立丝状支原体山羊亚种RPA方法，该方法灵敏度高，最低可检测到720fg/uL，特异性好、重复性好，可用于丝状支原体山羊亚种的临床诊断和流行病学调查。附图说明图1为丝状支原体山羊亚种RPA引物特异性检测结果。图中，M为Marker，泳道1为丝状支原体山羊亚种目标片段，泳道2为羊口疮病毒、泳道3为山羊支原体山羊肺炎亚种、泳道4为绵羊肺炎支原体、泳道5为山羊支原体山羊亚种、泳道6为大肠杆菌、泳道7为金黄色葡萄球菌、泳道8为溶血性曼氏杆菌、泳道9为牛支原体和泳道10莱氏无胆甾原体。图2为丝状支原体山羊亚种RPA引物灵敏性检测测结果。图中：M为Marker，1-9泳道模板浓度分别为72ng/uL、7.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA引物，其特征在于：所述引物上游P1: 5'‑ TTAGCTTATATGGATGCTGGTGGTTCATTC ‑3'，下游引物P2：5'‑ TTACTTCTCAAGGACCAACTAGAGTCATTG ‑3'；扩增片段大小为364 bp。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测丝状支原体山羊亚种的RPA引物，其特征在于：所述引物上游P1:5'-TTAGCTTATATGGATGCTGGTGGTTCATTC-3'，下游引物P2：5'...

【专利技术属性】
技术研发人员：林裕胜，胡奇林，江锦秀，游伟，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35