本发明专利技术提供了基于LAMP检测多肉植物茎腐病菌的引物组合及其应用。用于检测多肉植物茎腐病菌的LAMP引物组合由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如SEQ ID NO.1‑4所示。本发明专利技术的检测体系在65℃等温条件下，通过1 h温育，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到多肉植物茎腐病菌，不需要复杂昂贵的仪器，能较好地满足对多肉植物茎腐病菌的现场检测，可广泛应用于基层单位田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为防治多肉植物茎腐病提供可靠的技术和理论依据。
【技术实现步骤摘要】
基于LAMP检测多肉植物茎腐病菌的引物组合及其应用
本专利技术属于园艺作物病害检测、鉴定及防治
，具体涉及多肉植物茎腐病菌的环介导等温扩增（Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP）检测的引物组合及其应用，可用于多肉植物茎腐病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于多肉植物茎腐病的早期诊断和监测鉴定。
技术介绍
多肉植物是指植物营养器官肥大的高等植物，通常具根、茎、叶三种营养器官和花、果实、种子三种繁殖器官。在园艺上，又称肉质植物或多肉花卉，但以多肉植物这个名称最为常用。多肉植物作为盆栽在世界各地广受欢迎，目前常见的种类大多属于景天科和仙人掌科。茎腐病的病原为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)，是危害多肉植物的主要性真菌病害，属半知菌亚门真菌，也是一类世界性分布的真菌，分布极广，普遍存在于土壤及动植物有机体上，甚至存在于严寒的北极和干旱炎热的沙漠，属于兼寄生或腐生生物。它不仅可以在土壤中越冬和越夏，还会在不同的观赏植物上表现为不同的专化型；其专一性地引起观赏植物维管束病害，破坏植物的输导组织，并在植物生长发育代谢过程中产生毒素来危害作物，造成植物萎蔫死亡，影响产量和品质，该病是目前观赏花卉生产中防治比较困难的重要病害之一。多肉植物一遇此病会大量猝倒，萎缩死亡，植株茎部会开始出现褐色病斑，接着内部腐烂，直至全株猝倒死亡。由于多肉植物茎腐病是一种土传病害，防治上主要以预防为主，防治是否及时，直接影响了对土传病害的防治效果。因此生产上迫切需要建立一种快速、准确的检测多肉植物茎腐病菌的方法，为病害的早期诊断与防治、监测、预测预报提供支持和服务，对发展多肉植物生产、增加花农收入、减少环境污染和维持农业可持续发展，都具有重大的生产意义。当前，病原菌的检测方法较多，传统真菌菌种鉴定方法主要以形态学为依据，将菌种鉴定到纲、目、科、属、种。真菌的形态特征复杂，且有些菌类形态特征和生理生化特征随着环境的变化而不稳定，因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统的不一致。同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能直观的在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。随着生物化学、遗传学以及分子生物学的发展，为病原菌的分类鉴定提供了技术条件。如血清学免疫学技术、常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等技术为病原菌的分类鉴定提供了灵敏度高、快速的检测技术。但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处，如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性，PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR等，PCR技术检测时间较长，需要依赖贵重、精密的PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备及相应的高新技术人员，因而提高了检测成本，并限制了其应用范围，不利于基层生产上推广应用，限制了这些先进方法的推广应用。环介导等温扩增技术（LAMP）是由日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术，该技术可在60℃~65℃恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)对目的DNA片段进行特异性扩增。在1小时内，能够将少量拷贝数的目的基因扩增至109~1010个拷贝数。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低，LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real-timePCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBRGreenⅠ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，肉眼识别，大大降低了对实验人员的伤害，并且增加了在田间的应用价值。目前LAMP在植物病原菌检测中的应用逐年增多，而关于多肉植物茎腐病菌的LAMP检测国内外均未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中对多肉植物茎腐病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌传播、流行问题，而PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了基于环介导等温扩增技术（LAMP）检测多肉植物茎腐病菌的引物组合及其应用，对多肉植物茎腐病菌进行LAMP检测，具有检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果等优点。为实现上述目的，采用以下技术方案：1.多肉植物茎腐病菌LAMP检测特异性引物组合的设计：通过测定多肉植物茎腐病菌（Fusariumoxysporum）和其它镰刀菌（Fusariumspp）的translationelongationfactor1-alphagene(EF-1alpha)基因序列，对镰刀菌属及其它病原菌不同种间EF-1alpha基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件PrimersoftwareExplorerV4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html,EikenChemicalCo.,Japan)设计一套多肉植物茎腐病菌特异性LAMP引物组合，由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如下：F3:5'-CAGTATTCTGGCGGGCATG-3'，B3:5'-ACCTGATCCGAGGTCAACAT-3';FIP:5'-TGGGGAACGCGAATTAACGCGGAGCGTCATTTCAACCCTCA-3'，BIP:5'-GTCACGTCGAGCTTCCATAGCGAGAAGTTGGGGTTTAACGGC-3'。2.多肉植物茎腐病菌LAMP检测方法的建立，包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组DNA。用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µL2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（其包含：2%CTAB；100mmol·L-1Tris-HCl,pH8.0；20mmol·L-1EDTA,pH8.0；1.4mol·L-1NaCl）和90µLSDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000r·min-1离心15min；取上清液700µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各成分体积比25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min-1离心9min；取上清液500µL，加入1/10体积3mol·L-1NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min-1离心5min；弃去上清液，加入700µL冰70%乙醇进行洗涤（稍离心，倾掉上清液），在超净工作台上晾干至无酒精味，加入60µL无菌双蒸水（DDW）进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至100ng·µL-1待用。用于检测植物组织中多肉植物茎腐病菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于LAMP检测多肉植物茎腐病菌的引物组合，其特征在于：所述引物组合由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如下：F3: 5'‑ CAGTATTCTGGCGGGCATG‑3'，B3: 5'‑ ACCTGATCCGAGGTCAACAT‑3'；FIP:5'‑TGGGGAACGCGAATTAACGCGGAGCGTCATTTCAACCCTCA‑3'，BIP:5'‑GTCACGTCGAGCTTCCATAGCGAGAAGTTGGGGTTTAACGGC‑3'。
【技术特征摘要】
1.基于LAMP检测多肉植物茎腐病菌的引物组合，其特征在于：所述引物组合由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如下：F3:5'-CAGTATTCTGGCGGGCATG-3'，B3:5'-ACCTGATCCGAGGTCAACAT-3'；FIP:5'-TGGGGAACGCGAATTAACGCGGAGCGTCATTTCAACCCTCA-3'，BIP:5'-GTCACGTCGAGCTTCCATAGCGAGAAGTTGGGGTTTAACGGC-3'。2.如权利要求1所述的引物组合在多肉植物茎腐病菌LAMP检测中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其检测方法包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组DNA；（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25μL，反应体系中包含：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、8.0mMM...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚锦爱，黄鹏，陈汉鑫，余德亿，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35
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