一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物，所述引物上游P1：5'‑CTTAATGATGAGCGTAGTAGATACCAAACCAC‑3'，下游引物P2：5'‑GCTGAGGTCGGATTTGGACTAACAATAT TTG‑3'，该RPA引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明专利技术还提供一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA方法，包括引物合成，待测样品中DNA的提取、RPA扩增以及扩增产物分析等步骤，该检测方法操作简单，为基层兽医工作者有效检测和鉴定绵羊肺炎支原体提供一种快速、便捷、特异的诊断方法。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物
本专利技术属于兽医传染病快速诊断
，具体涉及一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物及方法。
技术介绍
绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae,Mo)是引起羊支原体性肺炎(Mycoplasmapneumoniaofgoatsandsheep,MPGS)的主要病原。MPGS传染性强，主要通过呼吸道感染，也可垂直传播，病羊和耐过羊是该病的主要传染源。MPGS临床症状表现为高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，发病率为20%～30%，病死率一般为30%～50%，有的高达80%。当前国外非洲、西班牙、意大利、美国、约旦，国内四川、贵州、内蒙古、青海、广西、福建等地均有该病发生的报道，给养羊业造成了严重的经济损失。常规PCR技术以其能够检测痕量的病因DNA而一直被作为诊断多种疫病的金标方法。但是PCR需要特殊的热循环设备，不利于基层推广使用。重组聚合酶扩增（RecombinasePolymeraseAmplification,RPA）技术是由英国公司TwistDxInc开发的一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链节和蛋白和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在38℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。目前已用于食品、药品、化妆品等领域的质量控制和环境、水质等监测；医学临床诊断，代谢性疾病和遗传疾病的基因诊断。绵羊肺炎支原体的诊断方法主要有支原体的分离鉴定、常规PCR、血清学方法和SYBRGreenIRF-PCR，然而Mo对培养基营养要求较高，且不易生长，培养周期需要很长时间；常规PCR和荧光定量PCR均需特殊仪器，血清学方法存在敏感性低、特异性差等缺点，无法及时对临床样品进行快速检测。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物及检测方法。本专利技术的RPA引物特异性强，能够检测绵羊肺炎支原体，为快速检测绵羊肺炎支原体提供一种有效方法，便于兽医基层工作者使用。为实现专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物，其中，所述RPA引物的核苷酸序列为：引物上游P1:5'-CTTAATGATGAGCGTAGTAGATACCAAACCAC-3'，下游引物P2：5'-GCTGAGGTCGGATTTGGACTAACAATATTTG-3'。扩增片段大小为353bp。上述RPA引物用于制备检测绵羊肺炎支原体的试剂。一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA方法，包括以下步骤：1)引物合成：合成所述RPA引物；2)DNA模板提取：提取样品中的DNA；3)RPA扩增反应：以步骤2）提取的DNA为模板，采用RPA引物、RehydrationBuffer和280mM醋酸镁，在RPA反应管仲进行RPA扩增反应；4)分析RPA扩增产物。根据上述的方法，采用英国TwistDxInc公司的TwistAmp®Basic试剂盒进行RPA扩增反应，所述RPA扩增反应体系为50μL：10μM上游引物和10μM下游引物各2.4μL、RehydrationBuffer29.5μL、无核酸酶纯水12.2μL、DNA模板1μL和280mM醋酸镁2.5μL。根据上述的方法，所述RPA扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将RPA反应体系中出了醋酸镁之外的成分加入到TwistAmp®Basic试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到反应管盖子内，盖上盖子瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中，然后将反应管放入38℃恒温水浴锅中孵育30min。步骤4）中分析RPA扩增产物的方法为：利用PCR纯化试剂盒回收扩增产物，然后经2%琼脂糖电泳对扩增产物进行检测。本专利技术的有益效果：（1）本专利技术设计的RPA引物特异性强，检测结果准确。（2）本专利技术建立绵羊肺炎支原体RPA方法，该方法灵敏度高，最低可检测到700fg/uL，特异性好、重复性好，可用于绵羊肺炎支原体的临床诊断和流行病学调查。附图说明图1为绵羊肺炎支原体RPA引物特异性检测结果。图中，M为Marker，泳道1为绵羊肺炎支原体目标片段，泳道2为羊口疮病毒、泳道3为山羊支原体山羊肺炎亚种、泳道4为丝状支原体山羊亚种、泳道5为山羊支原体山羊亚种、泳道6为大肠杆菌、泳道7为金黄色葡萄球菌、泳道8为溶血性曼氏杆菌、泳道9为牛支原体和泳道10莱氏无胆甾原体。图2为绵羊肺炎支原体RPA引物灵敏性检测测结果。图中：M为Marker，1-9泳道模板浓度分别为70ng/uL、7ng/uL、700pg/uL、70pg/uL、7pg/uL、700fg/uL、70fg/uL、7fg/uL、700ag/uL，10泳道为阴性对照。具体实施方式以下实施例中使用RPA试剂盒为TwistAmp®Basic试剂盒，购自英国TwistDxInc公司，整个RPA反应时在RPA管中进行。实施例1：用于检测绵羊肺炎支原体的RPA方法的建立1、引物的设计与合成引物的特异性是本实验所建立方法的重要因素。根据GenBank登录的KM435069.1的p80基因序列，利用Oligo7软件设计引物，通过BLAST软件比对分析，初步验证其特异性。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。所述RPA引物的核苷酸序列为：引物上游P1:5'-CTTAATGATGAGCGTAGTAGATACCAAACCAC-3'，下游引物P2：5'-GCTGAGGTCGGATTTGGACTAACAATATTTG-3'。扩增片段大小为353bp。2、阳性标准品制备以提取的DNA为模板，取1mL绵羊肺炎支原体培养液加入1.5mL离心管中，10000r/min离心3min，弃上清收集菌体，使用生工组织DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，作为阳性标准品备用。3、特异性试验分别以绵羊肺炎支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、大肠杆菌、溶血性曼氏杆菌、金黄色葡萄球菌、莱氏无胆甾原体、山羊支原体山羊亚种、牛支原体、丝状支原体山羊亚种、羊口疮病毒核酸样品为模版，采用TwistAmp®Basic试剂盒进行RPA扩增，验证合成RPA引物的特异性。所述RPA扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将RPA反应体系中出了醋酸镁之外的成分加入到TwistAmp®Basic试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到反应管盖子内，盖上盖子瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中，然后将反应管放入38℃恒温水浴锅中孵育30min。RPA扩增反应体系为50μL：10μM上游引物和10μM下游引物各2.4μL、RehydrationBuffer29.5μL、无核酸酶纯水12.2μL、DNA模板1μL和280mM醋酸镁2.5μL。反应结束后，利用PCR纯化试剂盒回收扩增产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物，其特征在于：所述引物上游P1: 5'‑ CTTAATGATGAGCGTAGTAGATACCAAACCAC ‑3'，下游引物P2：5'‑ GCTGAGGTCGGATTTGGACTAACAATATTTG ‑3'；扩增片段大小为353 bp。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA引物，其特征在于：所述引物上游P1:5'-CTTAATGATGAGCGTAGTAGATACCAAACCAC-3'，下游引物P2：5'-GCTGAGGTCGGATTTGGACTAACAATATTTG-3'；扩增片段大小为353bp。2.如权利要求1所述的RPA引物在制备检测绵羊肺炎支原体试剂中的应用。3.一种用于检测绵羊肺炎支原体的RPA检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1）引物合成：合成权利要求1所述RPA引物；2）DNA模板提取：提取样品中的DNA；3）RPA扩增反应：以步骤2）提取的DNA为模板，采用所述的RPA引物、Rehyd...

【专利技术属性】
技术研发人员：林裕胜，胡奇林，江锦秀，张靖鹏，游伟，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35