一种用于鼻腔菌群检测的方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于鼻腔菌群检测的方法及检测试剂盒。本发明专利技术提了一种用于样本菌群检测的成套引物，包括扩增细菌16S rDNA的V4‑V5区域的引物和扩增细菌16S rDNA的V1‑V9区域的引物；本发明专利技术先采用扩增效率高、特异性强、人源同源性低的V1‑V9引物先对16S rDNA片段进行富集，然后利用巢式PCR扩增出目的区段V4V5双片段，这样克服了直接用V4V5区段扩增引物与人源基因组序列同源性较高，在针对人源gDNA含量较高的鼻腔拭子样本进行扩增时，会出现严重的非特异扩增现象的问题。

A Method and Kit for Detecting Nasal Microflora

The invention discloses a method for detecting nasal microflora and a detection kit. The invention provides a set of primers for sample microflora detection, including primers for amplifying V4 V5 region of 16S rDNA of bacteria and V1 V9 region of 16S rDNA of bacteria. The method first uses V1 V9 primers with high amplification efficiency, strong specificity and low homology of human origin to enrich 16S rDNA fragments, and then benefits. The double fragments of target V4V5 were amplified by nested PCR, which overcomes the problem of high homology between primers amplified directly with V4V5 fragment and human genome sequence, and serious non-specific amplification would occur when nasal swab samples with high human gDNA content were amplified.

【技术实现步骤摘要】
一种用于鼻腔菌群检测的方法及检测试剂盒
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种用于鼻腔菌群检测的方法及检测试剂盒。
技术介绍
鼻腔内数以亿计的微生物在人体健康及疾病中有重要作用，研究表明，鼻窦炎、过敏性鼻炎、嗅觉减退、甚至阿兹海默症等疾病都与鼻腔菌群失调有关。鼻腔菌群主要从两个方面影响人体健康，一方面少数致病菌可以直接引发急性炎症，危害人体健康，另一方面，整个鼻腔共生细菌形成相对稳定的生态位，在帮助人体抵御病原体的入侵的同时，通过调节粘膜免疫，增强免疫耐受，避免过敏性疾病的发生。16SrDNA是细菌分类学研究中最常用的“分子钟”，其序列包含9个可变区和10个保守区。16SrDNA测序一般通过对一个或多个可变区进行扩增，然后利用高通量测序和序列分析对菌群进行属分类分析。该方法可突破传统微生物不可培养的缺点，快速获得大量菌群信息。16SrDNA扩增子测序不对细菌全基因组序列进行分析，只对保守区序列分析的技术特点赋予了它成本经济、分析方便、快速属水平分类的优点，近年来，在环境微生物、人体微生物等研究领域受到广泛应用。由于受目前高通量测序读长所限，很少采用16SrDNA的9个可变区全部测序的策略，一般选择1-3个可变区作为扩增片段。由于菌群的结构复杂，不同的可变区的区域对于菌群的分辨能力不同，利用不同可变区域进行分析时，菌群的覆盖度、结构分析的准确性和稳定性会有差异。例如，研究16SrDNA不同V区对菌群的覆盖度时，发现在门纲目科属五个水平，V4区域都有最好的覆盖度，覆盖度最高的相邻双片段区域为V4-V5区段。研究对16SrDNA基因的差异性对原核生物多样性高估程度时，发现V4-V5区域显示了最低的高估程度(约为3.0％)，而V6区域的高估程度最高(约为13％)。因此在菌群的多样性的研究中，16SrDNA基因的V4-V5区域更适合作为测序的目的片段。但是，目前针对鼻腔菌群16SrDNA测序方案一般选择对较容易扩增的单一V区进行检测，而非选择效果最好的V4V5区段，主要原因是常用的V4V5区段扩增引物与人源18SrDNA序列同源性较高，在针对菌群含量较低，而人源gDNA含量相对较高的鼻腔拭子样本进行扩增时，会出现严重的非特异扩增现象。需要进行技术优化以便提高鼻腔微生物的扩增特异性及富集效率。此外，目前的16SrDNA测序技术，常采用带有index的扩增引物进行16SrDNA扩增。该方法虽然简单，但是引物长度一般超过60nt，合成成本较高。同时，引物长度较长，扩增效率低。此外，扩增引物序列单一，高通量平行测序时容易因起始碱基不平衡性导致测序质量较差。也有先采用先进行16SrDNA扩增。然后通过连接方式添加测序接头。使得测序文库构建步骤繁琐，不利于大规模样本自动化建库。
技术实现思路
本专利技术一个目的是提供一种用于样本菌群检测的成套引物。本专利技术提供的成套引物，包括扩增细菌16SrDNA的V4-V5区域的引物和扩增细菌16SrDNA的V1-V9区域的引物；所述扩增细菌16SrDNA的V4-V5区域的引物由序列4所示的引物、序列5所示的引物、序列6所示的引物、序列7所示的引物、序列8所示的引物、序列9所示的引物、序列10所示的引物和序列11所示的引物组成。上述成套引物中，所述扩增细菌16SrDNA的V1-V9区域的引物由序列1所示的引物(FP1)、序列2所示的引物(RP1-1)和序列3所示的引物(RP1-2)组成。上述成套引物中，所述试剂盒还包括用于样本区分的上游引物和用于样本区分的下游引物，所述用于样本区分的上游引物由序列12所示的片段(illumina一个测序接头的另一部分，与上游引物中的测序接头区域形成illumina一个测序接头)、用于样本区分标签序列(index)和序列13所示的片段(与测序接头区段互补的区域)组成；在实施例中具体为FP3*；所述用于样本区分的上游引物由序列14所示的片段(illumina另一个测序接头的另一部分，与下游引物中的测序接头区域形成illumina另一个测序接头)、用于样本区分另一种标签序列和序列15所示的片段(与另一测序接头区段互补的区域)组成；在实施例中具体为RP3*；每个样本对应一种用于样本区分的标签序列和另一种标签用于样本区分的标签序列组成的组合。实施例中不同的标签序列由不同的8个碱基组成。本专利技术的另一个目的是提供含有上述的成套引物的PCR试剂或试剂盒。上述含有上述的成套引物的PCR试剂包括含有所述扩增细菌16SrDNA的V1-V9区域的引物的PCR试剂、含有所述扩增细菌16SrDNA的V4-V5区域的引物的PCR试剂和含有用于样本区分的引物的PCR试剂；所述含有所述扩增细菌16SrDNA的V1-V9区域的引物的PCR试剂中，所述序列1所示的引物、所述序列2所示的引物和所述序列3所示的引物的摩尔比为2:1:1；所述含有所述扩增细菌16SrDNA的V4-V5区域的引物的PCR试剂中，所述序列4所示的引物、序列5所示的引物、序列6所示的引物、序列7所示的引物、序列8所示的引物、序列9所示的引物、序列10所示的引物和序列11所示的引物的摩尔比为5:5:3:3:1:1:1:1；所述含有用于样本区分的引物的PCR试剂中，所述用于样本区分的上游引物和用于样本区分的下游引物的摩尔比为1:1。上述成套引物或上述PCR试剂或试剂盒在制备检测样本菌群产品中的应用也是本专利技术保护的范围；或，上述成套引物或上述PCR试剂或试剂盒在构建样本菌群测序文库中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述成套引物或上述PCR试剂或试剂盒在制备构建样本菌群测序文库产品中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述扩增细菌16SrDNA的V4-V5区域的引物和上述扩增细菌16SrDNA的V1-V9区域的引物在制备检测样本菌群产品中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述扩增细菌16SrDNA的V4-V5区域的引物和上述扩增细菌16SrDNA的V1-V9区域的引物在构建样本菌群测序文库中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述扩增细菌16SrDNA的V4-V5区域的引物和上述扩增细菌16SrDNA的V1-V9区域的引物在制备构建样本菌群测序文库产品中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术另一个目的是提供一种构建样本菌群测序文库的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)提取离体样本的DNA，2)以所述DNA为模板，用上述的试剂盒中的扩增细菌16SrDNA的V1-V9区域的引物进行PCR扩增，得到16SrDNA的V1-V9片段；3)以所述16SrDNA的V1-V9片段为模板，用上述的试剂盒中的扩增细菌16SrDNA的V4-V5区域的引物进行PCR扩增，得到16SrDNA的V4-V5片段；4)将所述16SrDNA的V4-V5片段用上述成套引物中的用于样本区分的上游引物和用于样本区分的下游引物进行扩增(用于Index添加)，得到鼻腔菌群测序文库。本专利技术还提供了一种提取离体样本的DNA的方法，包括如下步骤：1)蛋白酶K裂解离体样本，得到裂解产物；2)将所述裂解产物95℃孵育5min，弃去拭子，得到热处理裂解后产物；3)将所述热处理裂解后产物进行氧化锆珠机械裂解，得到机械裂解后产物；4)将所述机械裂解后产物纯化，实现离体样本的DNA提取。上述中，样本源于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于样本菌群检测的成套引物，包括扩增细菌16S rDNA的V4‑V5区域的引物和扩增细菌16S rDNA的V1‑V9区域的引物；所述扩增细菌16S rDNA的V4‑V5区域的引物由序列4所示的引物、序列5所示的引物、序列6所示的引物、序列7所示的引物、序列8所示的引物、序列9所示的引物、序列10所示的引物和序列11所示的引物组成。

【技术特征摘要】
1.一种用于样本菌群检测的成套引物，包括扩增细菌16SrDNA的V4-V5区域的引物和扩增细菌16SrDNA的V1-V9区域的引物；所述扩增细菌16SrDNA的V4-V5区域的引物由序列4所示的引物、序列5所示的引物、序列6所示的引物、序列7所示的引物、序列8所示的引物、序列9所示的引物、序列10所示的引物和序列11所示的引物组成。2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述扩增细菌16SrDNA的V1-V9区域的引物由序列1所示的引物、序列2所示的引物和序列3所示的引物组成。3.含有权利要求1或2所述的成套引物的PCR试剂，其包括含有所述扩增细菌16SrDNA的V1-V9区域的引物的PCR试剂、含有所述扩增细菌16SrDNA的V4-V5区域的引物的PCR试剂和含有用于样本区分的引物的PCR试剂。4.含有权利要求1或2所述的成套引物或含有权利要求3所述的PCR试剂的试剂盒。5.权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3所述的PCR试剂或权利要求4所述的试剂盒在制备检测样本菌群产品中的应用；或，权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3所述的PCR试剂或权利要求4所述的试剂盒在构建样本菌群测序文库中的应用；或，权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3所述的PCR试剂或权利要求4所述的试剂盒在制备构建样本菌群测序文库产品中的应用。6.权利要求1或2所述的成套引物中的扩增细菌16SrDNA的V4-V5区域的引物和权利要求1或2所述的成套引物中的扩增细菌16SrDNA的V1-V9区域的引物在制备检测样本菌群产品中的应用。7.权利要求1或2所述的成套引物中的扩增细...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓浩浩，郭弘妍，王辉，邢婉丽，程京，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11