一株高效降氮的蒙氏假单胞菌株CY06及其微生态制剂和应用制造技术

本发明专利技术提供了一株高效降氮的蒙氏假单胞菌株及其微生态制剂和应用。本发明专利技术公开的蒙氏假单胞Pseudomonas monteilii CY06的保藏号为CGMCC No.15249，本发明专利技术通过实验证明，所述蒙氏假单胞CY06对浓度2.5mg/L亚硝态氮降解率分别为96%。本发明专利技术中的蒙氏假单胞菌CY06为养殖水体改良微生态制剂提供了种源，以无污染和无残留的方式降低水中有害物质如氨氮和亚硝态氮，提高养殖品质，提高养殖经济效益，具有推广价值。

【技术实现步骤摘要】
一株高效降氮的蒙氏假单胞菌株CY06及其微生态制剂和应用
本专利技术属于水产微生态制剂
，具体涉及一株高效降氮的蒙氏假单胞菌株CY06及其微生态制剂和应用。
技术介绍
中国是全球最大的水产养殖国家，2016年，我国养殖水产品总量达5142.39万吨，占世界养殖水产品总量的70％以上，水产养殖为我国优质蛋白质的供给与农业经济的发展做出了巨大贡献。然而，水产养殖所带来的水体污染也是不容忽视，高密度的养殖模式，过量投饵，导致水体氨氮，尤其是亚硝态氮浓度过高，氨氮通过水体藻类生长尚可去除大部分，而亚硝态氮则无法被藻类利用，直接影响水产动物的代谢、免疫、生长等，增加发病率和死亡率，已经对水产养殖业造成了极大危害。另外，不经处理的养殖水体排放到外环境中产生面源污染，危害环境和养殖业的可持续发展。控制养殖池塘水体生态环境已是我国池塘水产养殖健康发展的关键问题，水产养殖池塘水质的控制和净化迫在眉睫。生物脱氮不仅安全环保，而且具有可续持性，但不同菌种及菌株降解亚硝酸盐效率差别较大，作用条件各不相同。为解决上述问题，本专利技术进行了高效降解亚硝酸盐菌种的筛选，评估其亚硝态氮降解性能，考察其最佳脱氮条件，并对其亚硝酸还原酶基因进行分析，为水产养殖中亚硝酸盐的控制提供有效的生物方法，从而改善养殖用水质量，促进水产养殖健康可持续发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一株高效降氮的蒙氏假单胞菌株及其微生态制剂和应用。本专利技术筛选到一株新的蒙氏假单胞菌菌株，CY06可以进行异养硝化及好氧反硝化脱氮反应。将其制备成微生态制剂，并用于改良养殖水体环境，明显提高了养殖的经济效应。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一株高效降氮的蒙氏假单胞菌株CY06，其分类命名为蒙氏假单胞菌株Pseudomonasmonteilii，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15249。进一步的：所述菌株CY06的菌落直径为3-4mm，颜色呈乳白色，无黏性，表面光滑扁平，质地均匀有光泽；革兰氏染色反应呈红色，菌体呈杆状。本专利技术提供了含有所述菌株CY06的微生态制剂。本专利技术提供了所述的微生态制剂在改良养殖水体中的应用。进一步的：所述微生态制剂用于降解水体中的氨氮和亚硝态氮，微生物制剂中菌株CY06的浓度为1×108cfu/mL～1×109cfu/mL。进一步的：所述微生态制剂中菌株CY06在盐度为5‰-20‰，对亚硝态氮的去除效果明显。进一步的：所述微生态制剂中菌株CY06改良水体的最适温度为30℃。进一步的：所述微生态制剂中菌株CY06改良水体的pH为5-10。进一步的：所述微生态制剂中菌株CY06脱氮的碳源为柠檬酸钠和/或丁二酸钠。进一步的：所述菌株CY06在养殖水体中的终浓度为1×104cfu/mL以上。与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术中的蒙氏假单胞菌(Pseudomonasmonteilii)CY06从江苏虾养殖厂分离得到，所述蒙氏假单胞菌CY06与现有的蒙氏假单胞菌区别于CY06可以在0‰、3‰、15‰盐浓度条件下均生长良好。该菌发挥反硝化作用的最适碳源为柠檬酸钠、丁二酸钠，对亚硝酸盐的去除率均近100％；最佳脱氮的温度为30℃；pH在5-10范围内都有较好的脱氮活性。本专利技术中的蒙氏假单胞菌(Pseudomonasmonteilii)CY06为养殖水体改良微生态制剂提供了种源，以无污染和无残留的方式降低水中有害物质如氨氮和亚硝态氮，提高养殖品质，提高养殖经济效益，具有推广价值。本专利技术中的蒙氏假单胞菌对浓度2.5mg/L亚硝态氮降解率为96％。附图说明图1是菌株CY06去除NH4+的实验结果；图2是菌株CY06对亚硝酸盐、硝酸盐的含量的影响；图3是不同盐度条件对菌株CY06脱氮效率的实验结果；图4是培养温度对CY06菌株反硝化效率的影响的实验结果；图5是初始pH值条件下菌株CY06对亚硝态氮的去除率的实验结果；图6是碳源对菌株CY06脱氮效率的影响的实验结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。实施例1、CY06菌株的筛选1、筛选蓝色晕圈且无溶血圈的菌株筛选样品采集自江苏、广东等地鱼塘和虾塘的水样、鱼样、虾样以及青岛海水样、沙土样等100个，采用倍比稀释法将采集的水样、土样进行梯度稀释，另将采集的鱼样和虾样先用酒精棉消毒，并解剖取其肝和肠，在少量无菌水中研磨并进行稀释涂布于BTB固体培养平板，放置于30℃恒温箱中进行培养20h，挑取周围有蓝色晕圈的菌落于LB平板上进行划线，并纯化两次。将纯化两次后的单菌落，用牙签点种在新鲜的溶血板上，放置于30℃恒温箱中观察24h、48h、72h，是否出现溶血圈。根据使血细胞琼脂溶血的能力分类：1)α溶血：草绿色溶血，菌落周围培养基出现1～2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；2)β溶血：完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；3)γ溶血：不溶血。将有溶血圈的菌株淘汰。将无溶血性的菌株在选择性固体培养基上划线，生长良好的菌株用LB液体培养，在30℃恒温扩大培养16h。LB培养基由1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl组成，pH7.0(若制备固体培养基加入1.5-2.0％琼脂，下同)。固体溴麝香草酚蓝培养基(BTB培养基)：丁二酸钠4.72g、亚硝酸钠0.375g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸铁0.05g、无水氯化钙0.2g、七水硫酸镁1g、溴百里酚蓝1g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。最终在BTB板上筛选到有蓝色晕圈且无溶血圈的菌株34株。2、高通量测定菌株降氮功能，筛选高效菌株在超净台中，将34株待测菌株菌液接入相应的筛选培养基中，接种终浓度为5×105CFU/mL，重复数为3；放入摇床中进行培养30℃，180r/min，培养48h；均匀取样到1.5mL离心管中，12000rpm离心3min，取上清200μL加入96孔板。测定亚硝态氮时，在96孔板中加入待测样上清液200μL后，每孔先后加入格里斯试剂A、B各20μL，于550nm比色测定。亚硝态氮筛选培养基：丁二酸钠4.72g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸铁0.05g、无水氯化钙0.2g、七水硫酸镁1g、亚硝酸钠母液1ml、蒸馏水定容至1000ml。亚硝酸钠母液为称取3.75gNaNO2加入1L蒸馏水，此时亚硝态氮浓度约为：2.5g/L。选取亚硝酸氮降解率高于70％的4株菌(编号为Y1-Y4)，以不接种任何菌株为阴性对照(CK)，进行重复测定。测定方法：在超净台中，将待测菌株菌液接入相应筛选培养基中，接种终浓度为5×105cfu/mL，重复数为3；放入摇床中进行培养30℃，180r/min，培养48h；均匀取样到1.5mL离心管中，12000r/min离心3min，取上清200μL加入96孔板。测定亚硝态氮时，在96孔板中加入待测样上清液200μL后，每孔先后加入格里斯试剂A、B各20μL，于550nm比色测定。定性测定：测定亚硝态氮时，溶液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等表示有亚硝酸盐还原，反应为阳性，即颜色越浅说明降解效果越佳。定量测定：制定亚硝态氮浓度(Y1)与测定OD值(X1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高效降氮的蒙氏假单胞菌株CY06，其特征在于：其分类命名为蒙氏假单胞菌株Pseudomonas monteilii，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15249。

【技术特征摘要】
1.一株高效降氮的蒙氏假单胞菌株CY06，其特征在于：其分类命名为蒙氏假单胞菌株Pseudomonasmonteilii，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15249。2.根据权利要求1所述的蒙氏假单胞菌株CY06，其特征在于：所述菌株CY06的菌落直径为3-4mm，颜色呈乳白色，无黏性，表面光滑扁平，质地均匀有光泽；革兰氏染色反应呈红色，菌体呈杆状。3.含有权利要求1所述菌株CY06的微生态制剂。4.权利要求3所述的微生态制剂在改良养殖水体中的应用。5.根据权利要求4所述的微生态制剂在改良养殖水体中的应用，其特征在于：所述微生态制剂用于降解水体中的氨氮和亚硝态氮，微生物制剂中菌株CY06的浓度为1×108cfu/mL~1×109...

【专利技术属性】
技术研发人员：何增国，蔡亚丽，马青山，
申请(专利权)人：青岛海洋生物医药研究院股份有限公司，青岛百奥安泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37