适用于猫犬间充质干细胞的低致敏性保存液及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种适用于猫犬间充质干细胞常温运输的低致敏性保存液，其包括蒸馏水，以及羟乙基淀粉130/0.4、葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠和氯化钠。本发明专利技术的适用于猫犬间充质干细胞常温运输的低致敏性保存液在常温下可较长时间、远距离运输间充质干细胞，能保证细胞活力和稳定性且可以直接输注入体内不引起过敏反应。

【技术实现步骤摘要】
适用于猫犬间充质干细胞的低致敏性保存液及其制备方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种适用于猫犬间充质干细胞的低致敏性保存液及其制备方法。
技术介绍
间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSC)是由中胚层发育而来的成体干细胞，其最先于骨髓当中分离得到，随后发现其存在于机体各个组织中，如脂肪、内脏、肌肉等及胎盘、羊膜、脐带等产后废弃组织。其具有自我更新和多向分化的能力，能在体内或体外诱导分化成脂肪、骨、软骨、神经等细胞。近年来，随着干细胞治疗的兴起，MSC被应用于血液疾病、皮肤创伤、肝肾损伤、关节炎、心肌炎和癌症等疾病的治疗，取得了令人满意的效果。MSC的运输是影响其临床推广与应用的重要因素，也是人们一直想要攻破的难题。常规的MSC运输包括超低温冻存运输和常温贴壁运输，超低温冻存运输成本高且对细胞损伤较大，冻存液中含有血清和DMSO等成分，解冻后不能直接输注到体内；常温贴壁运输方法维持细胞活性时间短，并且后续操作步骤繁多，不利于大范围临床推广。另外，如果进行简单的细胞输注前处理，则不能保证细胞的稳定性和长时间保存的活性，并且细胞运输过程中容易成团，常规吹打不能使其分开，影响后期治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种在常温下可较长时间、远距离运输间充质干细胞且能保证细胞活力和稳定性的保存液，该保存液可直接输注入体内，并不引起过敏反应。为此，本专利技术提供了以下技术方案。一种适用于猫犬间充质干细胞的低致敏性保存液，其包括蒸馏水，以及基于所述蒸馏水的重量计为1.5～4.5％的羟乙基淀粉130/0.4、0.5～1.5％的葡萄糖、0.014～0.042％的柠檬酸、0.2～0.6％的柠檬酸钠和0.9％的氯化钠。本专利技术还提供了所述适用于猫犬间充质干细胞的低致敏性保存液的制备方法，包括：按量称取羟乙基淀粉、葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钠并加入蒸馏水，溶解后高压灭菌，即得所述低致敏性保存液。本文所称“高压灭菌”指在密闭的高压蒸汽灭菌器内，利用压力大于常压的饱和水蒸汽来杀灭微生物，特别是在压力102.97～137.30kPa、温度121～126℃时进行蒸汽灭菌15～30分钟。本专利技术还提供了一种保存猫犬间充质干细胞的方法，其包括：将待保存的猫犬间充质干细胞加入所述适用于猫犬间充质干细胞的低致敏性保存液中。优选地，用所述低致敏性保存液将猫犬间充质干细胞密度调整至1×106～5×106/ml。利用本专利技术的适用于猫犬间充质干细胞的低致敏性保存液储存猫犬间充质干细胞，可以较远距离运输间充质干细胞并保证细胞的活力和稳定性，且配方中所有成分安全无毒，临床上可直接输注到体内，辅助治疗。此外，该保存液对以往人们常用的高蛋白成分进行改良，使得临床直接输注干细胞及储存液的致敏性大大降低，安全无毒副作用。附图说明图1示出了P3代犬脂肪间充质干细胞贴壁状态。图2示出了P3代猫脂肪间充质干细胞贴壁状态。图3是犬脂肪间充质干细胞接种至培养板6h后的细胞贴壁情况。图4是猫脂肪间充质干细胞接种至培养板6h后的细胞贴壁情况。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的详述，但本专利技术并不限于以下实施例。如未特别指出，以下所涉及的试剂均可通过商业途径购得。为简便起见，部分操作未详述操作的参数、步骤及所使用的仪器，应当理解，这些都是本领域技术人员所熟知并可重复再现的。1.间充质干细胞的培养(以猫、犬脂肪间充质干细胞为例)在无菌手术台中取健康犬(猫)腹股沟脂肪组织约1cm2于50ml离心管中，用生理盐水洗净血迹后用解剖剪将组织块剪碎，加入5ml浓度为1mg/ml的I型胶原酶置于37℃水浴锅中消化1h取出用200目筛网过滤，滤液在1200rmp下离心5min弃上清，用含10％胎牛血清、1％双抗、1％L-谷氨酰胺的DMEM培养液重悬沉淀后转移至培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱中。24h后进行第一次换液，洗去不贴壁的细胞及杂质，以后每隔2-3天换一次液。每天观察细胞状态，当贴壁至80％-90％时可进行传代。取P3代细胞进行成脂成骨分化，并用免疫荧光鉴定其表面蛋白CD34、CD44的表达情况。结果显示，犬和猫脂肪间充质干细胞均表达CD44表面标记，不表达CD34表面标记。如图1和图2所示，分别是P3犬、猫脂肪间充质干细胞贴壁状态(200×)，图片显示，细胞呈纤维状贴壁生长。2.细胞保存液的配制所述细胞运输保存液包括以下成分：羟乙基淀粉130/0.4、葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钠和蒸馏水，配制步骤如下：配方1：秤取羟乙基淀粉(130/0.4)3g、葡萄糖1g、柠檬酸0.028g、柠檬酸钠0.4g、氯化钠0.9g、蒸馏水100ml。配方2：秤取羟乙基淀粉(130/0.4)1.5g、葡萄糖1.5g、柠檬酸0.042g、柠檬酸钠0.6g、氯化钠0.9g、蒸馏水100ml。配方3：秤取羟乙基淀粉(130/0.4)4.5g、葡萄糖0.5g、柠檬酸0.014g、柠檬酸钠0.2g、氯化钠0.9g、蒸馏水100ml。以上配方分别将固体成分溶解于蒸馏水中后高压灭菌，放置在4℃的环境内，保存备用。以上所称“高压灭菌”指在密闭的高压蒸汽灭菌器内，利用压力大于常压的饱和水蒸汽来杀灭微生物，特别是在压力102.97～137.30kPa、温度121～126℃时进行蒸汽灭菌15～30分钟。3.间充质干细胞的运输前处理取贴壁至80％-90％的P3-P5代犬、猫脂肪间充质干细胞，用0.25％(质量浓度)胰蛋白酶消化后用含10％(质量浓度)胎牛血清的DMEM培养液终止消化，1200rpm离心5min，弃上清后用生理盐水重悬细胞，1200rpm再次离心5min弃上清。然后分别加入上述步骤配好的配方1至配方3的细胞保存液，调整细胞密度至1×106～5×106/ml，取1ml细胞悬液至2mlEP管中，密封管口运输。制备得到的犬、猫间充质干细胞悬液可直接进行局部注射或静脉注射到犬、猫体内，悬液需要在4-25℃避光环境下保存和运输，若环境温度超过30℃则可使用冰盒包装运输MSC。4.细胞活性检测用配方1至配方3的细胞保存液重悬的犬、猫间充质干细胞悬液分装好后置于4℃冰箱中保存，分别于第24h、48h、72h后取出，用0.4％台盼蓝染色后计活细胞数，活细胞排斥台盼蓝，死细胞则能被染成蓝色，由此可算出细胞成活率。放置72h后将细胞重新接种至培养板中，6h后观察细胞贴壁情况。细胞成活率如以下表1所示。表1常温运输条件下，不同时间后细胞成活率计算结果(n＝3，结果取平均值)放置72h后细胞接种至培养板6h后的细胞贴壁情况(以配方1为例，配方2和配方3结果类似)如图3和图4所示(200×)。其中，图3是犬脂肪间充质干细胞接种至培养板6h后的细胞贴壁情况。图4是猫脂肪间充质干细胞接种至培养板6h后的细胞贴壁情况。如图3和图4显示，细胞生长良好。此外，分别将用配方1至配方3的细胞保存液重悬的犬、猫间充质干细胞悬液分别直接输注入猫、犬体内，10例实际输注结果均表明没有引起过敏反应。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于猫犬间充质干细胞的低致敏性保存液，其特征在于包括蒸馏水，以及基于所述蒸馏水的重量计为1.5～4.5％的羟乙基淀粉130/0.4、0.5～1.5％的葡萄糖、0.014～0.042％的柠檬酸、0.2～0.6％的柠檬酸钠和0.9％的氯化钠。

【技术特征摘要】
1.一种适用于猫犬间充质干细胞的低致敏性保存液，其特征在于包括蒸馏水，以及基于所述蒸馏水的重量计为1.5～4.5％的羟乙基淀粉130/0.4、0.5～1.5％的葡萄糖、0.014～0.042％的柠檬酸、0.2～0.6％的柠檬酸钠和0.9％的氯化钠。2.权利要求1所述适用于猫犬间充质干细胞的低致敏性保存液的制备方法，其包括：按量称取羟乙基淀粉、葡...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹小舒，王丙云，罗冬章，罗惠娜，李东升，陈胜锋，陈志胜，丁毅力，
申请(专利权)人：广东维赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44