改进的成体肝脏祖细胞制备物制造技术

已经从不同的人供体制造了成体肝脏祖细胞(称为HHALPC)的制备物，并通过使用允许鉴定HHALPC制备物和/或用于其制备方法的细胞表面标志物进行了表征，所述制备物和/或方法最适合用于细胞治疗，特别是用于治疗肝病或遗传性凝血障碍。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的成体肝脏祖细胞制备物
本专利技术涉及使用原代肝脏细胞产生的成体肝脏祖细胞以及其用于肝病、遗传性凝血障碍(inheritedbloodcoagulationdisorder)的医疗管理或用于筛选具有医学目的的化合物的用途。
技术介绍
肝是调节机体稳态的关键器官，并且是许多重要代谢途径的场所。复杂代谢途径中仅一种蛋白质的损害便可能是非常有害的。重要肝酶的大量存在显著提高了多种肝病的风险发生。目前的治疗和长期管理不够有效。原位肝移植(Orthotopiclivertransplantation，OLT)是高侵入性的、不可逆的，受到供体移植物短缺的限制并且需要最先进的手术(state-of-artsurgery)。由于肝细胞制备物的质量，肝脏细胞移植(Livercelltransplantation，LCT)仅可能发挥短期至中期效力。在对低温保存的耐受性、永久植入、肝再生和输注细胞的高功能性方面的进一步改善将是重大突破(ChristB等，2015；BerardisS等，2015；ForbesS等，2015；IbarsE等，2016)。这种改善可以通过使用干细胞或祖细胞，特别是肝脏祖细胞来实现，在文献中已经使用来自不同生物体的肝组织以及在胎儿或成体肝组织中鉴定了肝脏祖细胞(SchmelzerE等，2007；SahinMB等，2008；AzumaH等，2003；HerreraMB等，2006；NajimiM等，2007；DarwicheH和PetersenBE，2010；ShiojiriN和NitouM，2012；TanakaM和MiyajimaA，2012)。这样的细胞在体外暴露于肝原性刺激后和/或在体内施用后可以为细胞提供通常与肝分化相关的形态和功能特征，例如I/II期酶活性。这些肝脏祖细胞或由它们产生的肝细胞样细胞可用于细胞移植以及用于新药物开发中的药物测试，因为在药物代谢以及体外药理学或毒理学筛选中它们代表了原代人肝细胞的替代物(DanYY，2012；HookLA，2012)。然而，目前还不可能确定到目前为止鉴定的哪些肝脏祖细胞是更适合于给定疾病的治疗或用途的那些，这主要是由于用于产生和表征这样的细胞以评估其在体内的潜在治疗效果的方法以及随后的药物用途的可变性。通常，间充质干细胞(例如具有间充质特征的成体肝脏祖细胞)的活性、扩增、迁移、植入、免疫原性和分化取决于特定的表面蛋白及其免疫学谱(BerardisS等，2014；SanaG等，2014；NajarM等，2013；RaicevicG等，2015)，特别是通过获得由不同供体和/或生产方法所获得的特定细胞亚群。然而，肝标志物、间充质标志物、四次跨膜蛋白(tetraspanin)、黏附标志物、细胞表面受体和其他类别的标志物的特定组合尚未用于鉴定来自不同人供体的肝脏祖细胞(或肝来源的间充质基质细胞)，所述肝脏祖细胞(或肝来源的间充质基质细胞)是在用于药物用途的细胞培养物中，即在GMP(良好生产规范)条件下生产的肝脏祖细胞。事实上，工业制造用于临床用途的肝脏祖细胞需要确定另外的可靠的标准，以允许在用于选择供体、细胞生产和配制、和/或选择的患者的整个过程表征其质量，由此使其具有有效的药物制备物和用途。
技术实现思路
本专利技术是基于以下观察结果：特定细胞培养条件允许获得来自不同人供体的、具有特定标志物谱的、和改善的生物特征的新成体肝脏祖细胞群。这样的细胞群可用于在GMP条件下生产基于细胞的药物组合物(或来自相应细胞培养物的条件化培养基)，其可用于组合物内，例如药物组合物，特别是用于治疗肝病、遗传性凝血障碍和其他人疾病。这些细胞制备物代表具有标志物谱(特别是细胞表面蛋白的表达和暴露)的细胞群，所述标志物谱将其表征为与先前描述的在非GMP条件下以从人供体分离的或其他方式从人供体产生的成体肝脏祖细胞群中鉴定的那些(例如在文献中鉴定的成体肝脏祖细胞，例如ADHLSC细胞)不同(NajimiM等，2007；KhuuDN等，2011；ScheersI等，2012；BerardisS等，2014；MaerckxC等，2014)。这些另外的表面标志物可以为用于制备药物制备物的相关标准提供改善的生存力、增殖、储存和/或功能特征，特别是当它们的确定与生物活性的评估相结合时，包括与特定药物组合物和这些细胞的用途相关的那些。此外，这些细胞表面标志物中的一些可以为表征旨在用于在GMP条件下制备期望的细胞群(制造之前或制造期间)的供体的肝细胞、或选择可以用这样的细胞制备物治疗的患者提供相关标准。本专利技术的一个主要实施方案包括成体肝脏祖细胞(称为HHALPC)，其可以通过GMP要求下的药物制造方法作为细胞群以及细胞制备物和包含其的药物组合物来提供。这些细胞和细胞群呈现可在其表面上鉴定的蛋白质标志物的组合，特别地所述细胞对以下测量为阳性：(a)间充质或多能标志物CD13、CD73、CD90和CD105；(b)黏附标志物CD29、CD44、CD47、CD49b、CD49c、CD49e和CD147；(c)四次跨膜蛋白CD9、CD63、CD81和CD151；以及(d)CD98、CD140b和β2-微球蛋白。这些细胞群可以通过对以下测量为阳性来进一步限定：(a)选自黏附标志物CD54、CD164、CD165和CD166的至少一种标志物；和/或(b)选自CD46、CD55、CD59和CD95的至少一种标志物。该细胞和相关细胞群可以通过一系列可以是阳性或阴性的细胞标志物在供体上和/或制造过程中进行表征。例如，细胞对选自以下的至少一种标志物测量为阳性：CD26、CD49a、CD49d、CD58、CD61、CD71、CD142、CD146、CD201、CD340和HLA-A/-B/-C。或者，细胞对选自以下的至少一种标志物测量为阴性：(a)CD26、CD49a、CD49d、CD58、CD61、CD71、CD142、CD146、CD201、CD340和HLA-A/-B/-C；和/或(b)CD45、CD117、CD34和HLA-DR中的一种或更多种。然后HHALPC可以进一步测量为对被确定为在细胞表面上、在细胞内分泌或以其他方式由HHALPC表达的一系列其他标志物和活性为阳性，包括：(a)对选自白蛋白、HNF-4和CYP3A4的至少一种肝标志物为阳性；(b)对选自波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin，ASMA)的至少一种间充质标志物为阳性；(c)对细胞角蛋白-19(CK-19)为阴性。可以以上述实施方案的任何功能和技术组合针对阳性和阴性标志物表征HHALPC，例如细胞和细胞群，其：(a)对CD13、CD73、CD90、CD105、CD29、CD44、CD47、CD49b、CD49c、CD49e、CD147、CD9、CD63、CD81、CD151、CD98、CD140b、β2-微球蛋白、CD54、CD164、CD165、CD166、CD46、CD55、CD59、CD95、白蛋白和波形蛋白为阳性；以及(b)对CD45、CD117、CD34和HLA-DR以及细胞角蛋白-19为阴性。细胞和细胞群包括在体外分化之前和/或之后(以及在动物模型和/或人对象中施用后)呈现细胞类型特异性特征，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.成体肝脏祖细胞，其特征在于所述细胞对以下测量为阳性：(a)间充质或多能标志物CD13、CD73、CD90和CD105；(b)黏附标志物CD29、CD44、CD47、CD49b、CD49c、CD49e和CD147；(c)四次跨膜蛋白CD9、CD63、CD81和CD151；以及(d)CD98、CD140b和β2‑微球蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.02 EP 16158327.31.成体肝脏祖细胞，其特征在于所述细胞对以下测量为阳性：(a)间充质或多能标志物CD13、CD73、CD90和CD105；(b)黏附标志物CD29、CD44、CD47、CD49b、CD49c、CD49e和CD147；(c)四次跨膜蛋白CD9、CD63、CD81和CD151；以及(d)CD98、CD140b和β2-微球蛋白。2.权利要求1所述的细胞，其特征在于所述细胞对以下测量为阳性：(a)选自黏附标志物CD54、CD164、CD165和CD166的至少一种标志物；和/或(b)选自CD46、CD55、CD59和CD95的至少一种标志物。3.权利要求1或2所述的细胞，其特征在于所述细胞对选自以下的至少一种标志物测量为阳性：CD26、CD49a、CD49d、CD58、CD61、CD71、CD142、CD146、CD201、CD340和HLA-A/-B/-C。4.权利要求1或2所述的细胞，其特征在于所述细胞对选自以下的至少一种标志物测量为阴性：(a)CD26、CD49a、CD49d、CD58、CD61、CD71、CD142、CD146、CD201、CD340和HLA-A/-B/-C；和/或(b)CD45、CD117、CD34和HLA-DR中的一种或更多种。5.权利要求1至4所述的细胞，其特征在于所述细胞进一步测量为：(a)对选自白蛋白、HNF-4和CYP3A4的至少一种肝标志物为阳性；(b)对选自波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的至少一种间充质标志物为阳性；以及(c)对细胞角蛋白-19(CK-19)为阴性。6.权利要求1所述的细胞，其特征在于所述细胞测量为：(a)对CD13、CD73、CD90、CD105、CD29、CD44、CD47、CD49b、CD49c、CD49e、CD147、CD9、CD63、CD81、CD151、CD98、CD140b、β2-微球蛋白、CD54、CD164、CD165、CD166、CD46、CD55、C...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡特琳·隆巴尔德，皮埃尔爱德华·多莱，艾蒂安·索卡尔，穆斯塔法·纳吉米，
申请(专利权)人：鲁汶大学，
类型：发明
国别省市：比利时,BE