一种去除PK15细胞中支原体的方法技术

本发明专利技术公开了一种去除PK15细胞中支原体的方法，具体包括以下步骤：(1)分别配置DMEM培养基和0.25％胰酶，然后经滤菌器分别进行过滤，将牛血清进行消毒和灭活处理后进行分装备用；(2)将长满单层的PK15细胞用步骤(1)制备的0.25％胰酶消化分散，加入细胞生长液进行传代；(3)加入Plasmocin treatment试剂，继续培养；(4)待PK15细胞长成致密单层后进行传代，选用含有25μg/ml的Plasmocin treatment试剂的步骤(2)中配制的细胞生长液作为传代培养基，待PK15细胞长满后按1:5加入所述的传代培养基再连续传代4代，即获得无支原体的PK15细胞。本发明专利技术能够有效去除PK15细胞中的支原体，且用时较短，获得的无支原体的PK15细胞在后期传代过程中无需再使用Plasmocin treatment试剂，也不会发生细胞的二次感染。

A method for removing mycoplasma from PK15 cells

The invention discloses a method for removing mycoplasma from PK15 cells, which includes the following steps: (1) configuring DMEM culture medium and 0.25% trypsin respectively, then filtering through filters, sterilizing and inactivating bovine serum for separate equipment; (2) using steps for preparing single-layer PK15 cells; (1) preparing 0.25% trypsin. Trypsinase was digested and dispersed, and cell growth liquid was added for passage; (3) Plasmocin treatment reagent was added for further culture; (4) PK15 cells were subcultured when they grew into dense monolayer. The steps of using PLASMOcin treatment reagent containing 25 ug/ml were selected. (2) Cell growth liquid prepared in the process was used as the medium for passage until the PK15 cells were full-grown. 1:5 was added to the passages and continuously passaged for 4 generations, that is, PK15 cells without Mycoplasma were obtained. The invention can effectively remove mycoplasma from PK15 cells, and the time is short. The obtained PK15 cells without Mycoplasma need not use Plasmocin treatment reagent in the later passage process, and no secondary infection of cells will occur.

【技术实现步骤摘要】
一种去除PK15细胞中支原体的方法
本专利技术属于细胞生物学
，具体涉及一种去除PK15细胞中支原体的方法。
技术介绍
支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5μm之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。目前对细胞的支原体去除方法多是用不同抗生素进行去除，比如氟喹诺酮类、四环素类衍生物、大环内酯类抗生素，其处理方法为：(1)获取待处理的细胞；(2)用含10μg/ml环丙沙星的培养基培养所述待处理的细胞；(3)定时更新所述培养基，并且使所述待处理的细胞的生长密度保持在50％～80％；(4)检测不到支原体污染的情况之后停止使用所述培养基。这些抗生素在使用一段时间后细胞支原体变成阴性，但细胞在不添加这些抗生素继续传代十几代后，支原体检测又变成的阳性。支原体约有1％可通过滤菌器，用普通染色法不易着色，因此在普通光学显微镜下不易被发现。商品化的Plasmocin(支原体抗生素)主要用于治疗或预防细胞培养中支原体污染。Plasmocin含有两种杀菌成分，可以强效对抗支原体及相关的无胞壁的细菌。它的显著效果主要是其含有两种独特的抗菌成分，一种成分通过干扰核糖体的翻译功能而使蛋白合成受阻，另一种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA的复制，而这两种成分的靶分子只存在于支原体和许多其他细菌中而并不存在于真核细胞中。0.1μm滤菌器过滤后，不能彻底截留支原体；而过高浓度的Plasmocin可能对细胞产生伤害，并且若培养基、添加剂本身就有支原体污染，单独采用Plasmocin去除效果不明显。所以单使用上述任何一种方法都不能保证彻底清除支原体。专利技术专利CN104073472A公开了一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法，该种去除PCV2病毒中支原体污染的方法包括步骤：0.1μm滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代，PCV2病毒用终浓度2.5μg/ml的Plasmocin处理两代，常规繁殖PCV2两代。该专利采用先过滤再用抗生素的方法，不仅节省了实验成本，更为重要的是抗生素使用次数少，浓度小，去除支原体时间短，整个处理过程仅需8代，约16～20天可完成，且不会使PCV2病毒效价降低，可为疫苗生产提供无支原体且病毒效价高的PCV2病毒，并为单位体积内疫苗半成品病毒含量的提高提供了保障。但是，常规的细胞培养一般是用透气细胞瓶或者密封的细胞瓶将瓶塞松开一点口，保持细胞通透性，但这样做在环境中有支原体的情况下，容易使支原体进入细胞瓶，进而感染瓶内细胞。为此，我们寻找一种能有效去除PK15细胞的支原体方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术通过提供一种去除PK15细胞中支原体的方法，以便能够有效去除PK15细胞中的支原体。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种去除PK15细胞中支原体的方法，具体包括以下步骤：(1)分别配置DMEM培养基和0.25％胰酶，然后经滤菌器分别进行过滤，将牛血清进行消毒和灭活处理后进行分装备用；(2)将步骤(1)处理分装的牛血清加入到DMEM培养基中配置成细胞生长液，将长满单层的PK15细胞用步骤(1)制备的0.25％胰酶消化分散，按照1:5比例加入细胞生长液于不透气的T25细胞培养瓶中进行传代；(3)向步骤(2)获得的T25细胞培养瓶内的细胞悬液中加入Plasmocintreatment试剂，继续培养；(4)待PK15细胞长成致密单层后进行传代，选用含有25μg/ml的Plasmocintreatment试剂的步骤(2)中配制的细胞生长液作为传代培养基，待PK15细胞长满后按1:5加入所述的传代培养基再连续传代4代，即获得无支原体的PK15细胞。优选的，步骤(1)中，所述滤菌器的规格为0.1μm。优选的，步骤(1)中，所述牛血清经钴60照射消毒，然后在56℃、30分钟条件下灭活处理后分装备用。进一步，步骤(1)中，经滤菌器分别过滤后，需经PCR分别检测所述的DMEM培养基、0.25％胰酶均为阴性；灭活后的牛血清也为支原体阴性。优选的，步骤(2)中，所述细胞生长液中牛血清含量为8％。优选的，步骤(3)中，按照1000:1的体积比向T25细胞培养瓶内的细胞悬液中加入Plasmocintreatment试剂；继续培养的条件为在密封状态下置于37℃恒温培养箱中培养。进一步，经由步骤(4)制备获得的所述的无支原体的PK15细胞在传代使用时，需要使用步骤(1)制备的不含支原体的DMEM培养基、牛血清和0.25％胰酶，且需要在密封状态下培养，但是无需加入Plasmocintreatment试剂。与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果：(1)现有技术中，往往常用环丙沙星进行支原体去除，但是，经由环丙沙星处理的细胞会产生依赖性，不再使用环丙沙星后，传几代即会再次检测到支原体的存在。(2)相对于单独使用滤菌器或者Plasmocin都不能保证彻底清除支原体，本专利技术采用联合0.1μm的滤菌器和Plasmocintreatment两种方法，先用0.1μm的滤菌器处理培养基、添加剂原材料，然后再用Plasmocintreatment试剂处理，待PK15细胞长成致密单层后进行传代，选用含有25μg/ml的Plasmocintreatment试剂的细胞生长液作为传代培养基，待PK15细胞长满致密单层后按1:5传代，且每代细胞生长液均含25ug/ml的Plasmocintreatment试剂再连续传代4代，即可彻底消除PK15中的支原体。本专利技术中抗生素仅使用5次，去除支原体时间短，整个处理过程仅需5代，约20天可完成，即获得无支原体的PK15细胞。(3)在后期培养中，相对于现有技术采用0.22um的透气塞滤膜，本专利技术的细胞培养瓶采用密封不透气的处理，即使环境中或培养箱中有支原体污染，也不会进入到细胞瓶中，因此在传代过程中不会发生细胞的二次感染。(4)本专利技术着重强调了在细胞培养传代过程用所用试剂如培养基、血清、胰酶应为支原体阴性，这三种成分可能含支原体量不高，用支原体培养方法检测不到，但用PCR方法是可以检测到支原体阳性的，所以本专利技术强调了所用试剂为支原体阴性的重要性。(5)本专利技术的方法不仅能去除PK15细胞的支原体，也可以去除Marc145、Vero细胞中的支原体。综上所述，利用本专利技术的方法能够有效去除PK15细胞中的支原体，且用时较短，获得的无支原体的PK15细胞在后期传代过程中无需再使用Plasmocintreatment试剂，也不会发生细胞的二次感染。附图说明图1为经过支原体去除剂Plasmocintreatment处理的PK15细胞F10代的电镜检测结果；图2为F1‐F4代PK15细胞支原体检测情况；图3为F12、F20、F25代的PK15细胞支原体检测情况；图4为F25代PK15细胞的电镜检测结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。实施例1一种去除PK15细胞中支原体的方法，具体包括以下步骤：(1)按DMEM培养基(gbicoDulbecco’sModifiedEagleMediumhighglucose培养基，gbico，REF12100‐046)说明书配置DMEM培养基，按2015年版中华人民共和国兽药典附录方法配制0.25％胰酶(索莱宝本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种去除PK15细胞中支原体的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)分别配置DMEM培养基和0.25％胰酶，然后经滤菌器分别进行过滤，将牛血清进行消毒和灭活处理后进行分装备用；(2)将步骤(1)处理分装的牛血清加入到DMEM培养基中配置成细胞生长液，将长满单层的PK15细胞用步骤(1)制备的0.25％胰酶消化分散，按照1:5比例加入细胞生长液于不透气的T25细胞培养瓶中进行传代；(3)向步骤(2)获得的T25细胞培养瓶内的细胞悬液中加入Plasmocin treatment试剂，继续培养；(4)待PK15细胞长成致密单层后进行传代，选用含有25μg/ml的Plasmocin treatment试剂的步骤(2)中配制的细胞生长液作为传代培养基，待PK15细胞长满后按1:5加入所述的传代培养基再连续传代4代，即获得无支原体的PK15细胞。

【技术特征摘要】
1.一种去除PK15细胞中支原体的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)分别配置DMEM培养基和0.25％胰酶，然后经滤菌器分别进行过滤，将牛血清进行消毒和灭活处理后进行分装备用；(2)将步骤(1)处理分装的牛血清加入到DMEM培养基中配置成细胞生长液，将长满单层的PK15细胞用步骤(1)制备的0.25％胰酶消化分散，按照1:5比例加入细胞生长液于不透气的T25细胞培养瓶中进行传代；(3)向步骤(2)获得的T25细胞培养瓶内的细胞悬液中加入Plasmocintreatment试剂，继续培养；(4)待PK15细胞长成致密单层后进行传代，选用含有25μg/ml的Plasmocintreatment试剂的步骤(2)中配制的细胞生长液作为传代培养基，待PK15细胞长满后按1:5加入所述的传代培养基再连续传代4代，即获得无支原体的PK15细胞。2.根据权利要求1所述的去除PK15细胞中支原体的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述滤菌器的规格为0.1μm。3.根据权利要求2所述的去除PK15细胞中支原体的方法，其特征在于：步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭春丽，王学波，刘志亮，王丹娜，常娓娓，罗济冠，李晓林，王相芹，李朝阳，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，青岛信得药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37