基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。该方法包括：(1)对小鼠十二指肠、空肠和回肠区段的隐窝进行分离；(2)对小鼠十二指肠、空肠和回肠区段的隐窝进行3D培养，形成类器官；(3)小鼠小肠类器官传代；(4)小鼠小肠类器官冻存；(5)小鼠小肠类器官复苏；(6)小鼠小肠类器官冰冻切片制备；(7)小鼠小肠类器官冰冻切片免疫荧光标记及鉴定。相比于现有技术，本发明专利技术以含有干细胞的小肠隐窝为基础，优化了隐窝提取方式、体外培养体系和培养基，并包含完整的培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。此方法获得小肠类器官可以反复传代，且传代类器官具有性状稳定性。

【技术实现步骤摘要】
基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法
本专利技术涉及一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。
技术介绍
小肠作为人体最大的营养物质消化和吸收器官，由于其在代谢紊乱疾病如肥胖及糖尿病的重要作用，人们对肠道营养物质吸收、转运、感受和激素释放的兴趣日益增长。目前用于小肠营养物感受、转运、吸收及局部激素调节功能研究的体外模型主要分为两类：一类是以肠道组织为基础的模型，包括环法、外翻肠囊、尤斯灌流室和离体肠灌注，上述模型可以用于正常生理条件下微生物、上皮细胞、免疫细胞、神经细胞及其他细胞在组织中的相互作用；一类是以肿瘤细胞系为基础的模型，包括各种转化的肠道上皮细胞系，如Caco-2，HT29，NCI-H716，STC-1等，上述Caco-2细胞模型结合跨膜分析技术(Transwell)可以产生极化上皮层，用于体外上皮细胞反应研究。但是，上述肠道功能体外研究模型均存在一定缺陷：肠道组织基础上的模型，因为上述模型需要获取离体组织，实验对象数量有限情况下将无法获得足够质量及数量的组织，而且离体组织具有时间有效性，因此只有有限的功能测试时间，实验的重复性及稳定性差。同时为了获取足够数据，动物使用量高。细胞基础上的模型，细胞组成单一，无法真正再现肠道细胞与细胞之间，细胞与细胞基质之间的相互作用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。该方法区别于现有技术，优化了隐窝提取方式、体外培养体系和培养基，并包含了完整的培养、传代、冻存、复苏和鉴定等方法。进一步地，此培养方法获得小肠类器官可以反复传代，且传代类器官具有性状稳定性。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏方法，包括以下几个步骤：步骤一、收集一只8-10周大的雄性C57BL/6小鼠的小肠，放入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液中，置于冰上；用眼科镊清除小肠残留肠系膜，将小肠从十二指肠段沿纵轴纵向剖开，用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗去除肠道中的食糜，得到清洗干净的小肠；将清洗完毕的小肠分成三等分，分别剪取前端靠近胃部的4厘米小肠作为十二指肠段，中间段小肠的中间部4厘米为空肠段，后端靠近回盲肠部的4厘米为回肠段；将三段小肠部位用无水乙醇中浸泡5分钟后，用消毒盖玻片沿小肠绒毛面轻轻刮三段小肠部位2-3次；用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗三段小肠；用眼科剪将三段小肠沿纵轴剪成3-5毫米的小段，将十二指肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管1中清洗，将空肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管2中清洗，将回肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管3中清洗，清洗时分别将离心管1、2和3轻轻来回颠倒10-15次；清洗完毕后，将离心管1、2和3分别置于冰上使小肠碎片自然沉降于离心管1、2和3底部，然后去除上清液；分别在离心管1和2中加入8毫升预冷的浓度为2mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40-50rpm的速度振荡30分钟进行消化；在离心管3中加入8毫升预冷的浓度为5mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40-50rpm的速度振荡45分钟进行消化；将离心管1、2和3分别置于冰上自然沉降，去除上清液；向离心管1、2和3中分别加入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，将离心管1、2和3分别上下颠倒10-15次进行清洗；步骤二，将步骤一中清洗完成的离心管1、2和3置于冰上自然沉降，去除上清液后，分别加入7.5毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，轻柔振荡50次，脱出小肠碎片中的隐窝，随后将离心管1、2和3置于冰上自然沉降后，将离心管1、2和3上清液合并收集至50毫升离心管4中；采用100微米孔径的细胞筛对离心管4中的上清液进行过滤，滤液转移至50毫升离心管5中；重复多次，直至每100微升离心管4中的收集液中少于10个隐窝时，停止收集；步骤三、将步骤二中得到的含有隐窝的离心管5以150g转速和4℃温度下离心10分钟；去除离心管5中的上清液，加入3毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，得隐窝悬液，移液枪吸取20微升隐窝悬液，滴于载玻片上，倒置显微镜下计数隐窝数量；将隐窝悬液转移到15毫升离心管6中以150g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管6中的上清液，得隐窝沉淀，并将隐窝沉淀置于冰上；步骤四、向步骤三中得到的隐窝沉淀中按照每孔50微升的剂量加入相应体积的冰上预融化的复合凝胶液，用预冷移液枪头在冰上轻轻吹打形成均匀小肠隐窝复合凝胶悬液1；将小肠隐窝复合凝胶悬液1按照每孔50微升体积接种于37℃预热的24孔培养板1中；将24孔培养板1置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板1的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到初代小肠类器官；步骤五、在步骤四接种后6天，去除步骤四中24孔培养板中培养基，然后在每孔中加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液2；用注射器吸取全部复合凝胶悬液2后推出，重复一次，使隐窝类似结构从小肠类器官中释放，得到解离小肠类器官悬液1；将解离小肠类器官悬液1转移至15毫升离心管7中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管7中上清液；向含有解离小肠类器官悬液1的离心管7中加入150-250微升冰上预融化的复合凝胶液，用移液枪吹打3-4次制成冰上预融化的复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板2中；将24孔培养板2置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板2的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到传代小肠类器官；步骤六、在步骤五小肠类器官传代3天后，将24孔培养板2中的传代小肠类器官去除培养基后，加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3转移至15毫升离心管8中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管8中上清液；在离心管8中加入1毫升冻存液后，得小肠类器官重悬液；以2-3孔小肠类器官重悬液为一组，转移至一根2毫升冻存管中，放于含异丙醇的冻存盒中，-80℃放置24小时后放入液氮中长期保存，得到冻存小肠类器官；步骤七、将存有小肠类器官重悬液的冻存管从液氮中取出，立即放入37℃水浴锅中速溶，待小肠类器官重悬液完全融化后，转移小肠类器官重悬液到15毫升离心管9中，加入预冷基础培养基至5毫升，在转速200g条件下离心10分钟；去除离心管9的上清液后，加入100微升复合凝胶液，得到小肠类器官复苏重悬液；将小肠类器官复苏重悬液按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板3中；将24孔培养板3置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板3的每孔中加入500微升完全培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏方法，其特征在于包括以下几个步骤：步骤一、收集一只8‑10周大的雄性C57BL/6小鼠的小肠，放入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液中，置于冰上；用眼科镊清除小肠残留肠系膜，将小肠从十二指肠段沿纵轴纵向剖开，用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗去除肠道中的食糜，得到清洗干净的小肠；将清洗完毕的小肠分成三等分，分别剪取前端靠近胃部的4厘米小肠作为十二指肠段，中间段小肠的中间部4厘米为空肠段，后端靠近回盲肠部的4厘米为回肠段；将三段小肠部位用无水乙醇中浸泡5分钟后，用消毒盖玻片沿小肠绒毛面轻轻刮三段小肠部位2‑3次；用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗三段小肠；用眼科剪将三段小肠沿纵轴剪成3‑5毫米的小段，将十二指肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管1中清洗，将空肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管2中清洗，将回肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管3中清洗，清洗时分别将离心管1、2和3轻轻来回颠倒10‑15次；清洗完毕后，将离心管1、2和3分别置于冰上使小肠碎片自然沉降于离心管1、2和3底部，然后去除上清液；分别在离心管1和2中加入8毫升预冷的浓度为2mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40‑50rpm的速度振荡30分钟进行消化；在离心管3中加入8毫升预冷的浓度为5mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40‑50rpm的速度振荡45分钟进行消化；将离心管1、2和3分别置于冰上自然沉降，去除上清液；向离心管1、2和3中分别加入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，将离心管1、2和3分别上下颠倒10‑15次进行清洗；步骤二，将步骤一中清洗完成的离心管1、2和3置于冰上自然沉降，去除上清液后，分别加入7.5毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，轻柔振荡50次，脱出小肠碎片中的隐窝，随后将离心管1、2和3置于冰上自然沉降后，将离心管1、2和3上清液合并收集至50毫升离心管4中；采用100微米孔径的细胞筛对离心管4中的上清液进行过滤，滤液转移至50毫升离心管5中；重复多次，直至每100微升离心管4中的收集液中少于10个隐窝时，停止收集；步骤三、将步骤二中得到的含有隐窝的离心管5以150g转速和4℃温度下离心10分钟；去除离心管5中的上清液，加入3毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，得隐窝悬液，移液枪吸取20微升隐窝悬液，滴于载玻片上，倒置显微镜下计数隐窝数量；将隐窝悬液转移到15毫升离心管6中以150g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管6中的上清液，得隐窝沉淀，并将隐窝沉淀置于冰上；步骤四、向步骤三中得到的隐窝沉淀中按照每孔50微升的剂量加入相应体积的冰上预融化的复合凝胶液，用预冷移液枪头在冰上轻轻吹打形成均匀小肠隐窝复合凝胶悬液1；将小肠隐窝复合凝胶悬液1按照每孔50微升体积接种于37℃预热的24孔培养板1中；将24孔培养板1置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板1的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到初代小肠类器官；步骤五、在步骤四接种后6天，去除步骤四中24孔培养板中培养基，然后在每孔中加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液2；用注射器吸取全部复合凝胶悬液2后推出，重复一次，使隐窝类似结构从小肠类器官中释放，得到解离小肠类器官悬液1；将解离小肠类器官悬液1转移至15毫升离心管7中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管7中上清液；向含有解离小肠类器官悬液1的离心管7中加入150‑250微升冰上预融化的复合凝胶液，用移液枪吹打3‑4次制成冰上预融化的复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板2中；将24孔培养板2置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板2的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到传代小肠类器官；步骤六、在步骤五小肠类器官传代3天后，将24孔培养板2中的传代小肠类器官去除培养基后，加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3转移至15毫升离心管8中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管8中上清液；在离心管8中加入1毫升冻存液后，得小肠类器官重悬液；以2‑3孔小肠类器官重悬液为一组，转移至一根2毫升冻存管中，放于含异丙醇的冻存盒中，‑80℃放置24小时后放入液氮中长期保存，得到...

【技术特征摘要】
1.基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏方法，其特征在于包括以下几个步骤：步骤一、收集一只8-10周大的雄性C57BL/6小鼠的小肠，放入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液中，置于冰上；用眼科镊清除小肠残留肠系膜，将小肠从十二指肠段沿纵轴纵向剖开，用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗去除肠道中的食糜，得到清洗干净的小肠；将清洗完毕的小肠分成三等分，分别剪取前端靠近胃部的4厘米小肠作为十二指肠段，中间段小肠的中间部4厘米为空肠段，后端靠近回盲肠部的4厘米为回肠段；将三段小肠部位用无水乙醇中浸泡5分钟后，用消毒盖玻片沿小肠绒毛面轻轻刮三段小肠部位2-3次；用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗三段小肠；用眼科剪将三段小肠沿纵轴剪成3-5毫米的小段，将十二指肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管1中清洗，将空肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管2中清洗，将回肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管3中清洗，清洗时分别将离心管1、2和3轻轻来回颠倒10-15次；清洗完毕后，将离心管1、2和3分别置于冰上使小肠碎片自然沉降于离心管1、2和3底部，然后去除上清液；分别在离心管1和2中加入8毫升预冷的浓度为2mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40-50rpm的速度振荡30分钟进行消化；在离心管3中加入8毫升预冷的浓度为5mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40-50rpm的速度振荡45分钟进行消化；将离心管1、2和3分别置于冰上自然沉降，去除上清液；向离心管1、2和3中分别加入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，将离心管1、2和3分别上下颠倒10-15次进行清洗；步骤二，将步骤一中清洗完成的离心管1、2和3置于冰上自然沉降，去除上清液后，分别加入7.5毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，轻柔振荡50次，脱出小肠碎片中的隐窝，随后将离心管1、2和3置于冰上自然沉降后，将离心管1、2和3上清液合并收集至50毫升离心管4中；采用100微米孔径的细胞筛对离心管4中的上清液进行过滤，滤液转移至50毫升离心管5中；重复多次，直至每100微升离心管4中的收集液中少于10个隐窝时，停止收集；步骤三、将步骤二中得到的含有隐窝的离心管5以150g转速和4℃温度下离心10分钟；去除离心管5中的上清液，加入3毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，得隐窝悬液，移液枪吸取20微升隐窝悬液，滴于载玻片上，倒置显微镜下计数隐窝数量；将隐窝悬液转移到15毫升离心管6中以150g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管6中的上清液，得隐窝沉淀，并将隐窝沉淀置于冰上；步骤四、向步骤三中得到的隐窝沉淀中按照每孔50微升的剂量加入相应体积的冰上预融化的复合凝胶液，用预冷移液枪头在冰上轻轻吹打形成均匀小肠隐窝复合凝胶悬液1；将小肠隐窝复合凝胶悬液1按照每孔50微升体积接种于37℃预热的24孔培养板1中；将24孔培养板1置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板1的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到初代小肠类器官；步骤五、在步骤四接种后6天，去除步骤四中24孔培养板中培养基，然后在每孔中加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液2；用注射器吸取全部复合凝胶悬液2后推出，重复一次，使隐窝类似结构从小肠类器官中释放，得到解离小肠类器官悬液1；将解离小肠类器官悬液1转移至15毫升离心管7中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管7中上清液；向含有解离小肠类器官悬液1的离心管7中加入150-250微升冰上预融化的复合凝胶液，用移液枪吹打3-4次制成冰上预融化的复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板2中；将24孔培养板2置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板2的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到传代小肠类器官；步骤六、在步骤五小肠类器官传代3天后，将24孔培养板2中的传代小肠类器官去除培养基后，加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3转移至15毫升离心管8中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管8中上清液；在离心管8中加入1毫升冻存液后，得小肠类器官重悬液；以2-3孔小肠类器官重悬液为一组，转移至一根2毫升冻存管中，放于含异丙醇的冻存盒中，-80℃放置24小时后放入液氮中长期保存，得到冻存小肠类器官；步骤七、将存有小肠类器官重悬液的冻存管从液氮中取出，立即放入37℃水浴锅...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩剑众，秦玉梅，王稣嫱，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33