呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法技术

本发明专利技术公开一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，包括以下步骤：配制细胞培养液；将猪小肠上皮细胞接种至细胞培养液中培养，获得待诱导细胞；向待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞；测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin‑1蛋白表达以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用。本发明专利技术以呕吐毒素为诱导剂，成功建立猪小肠上皮细胞程序性坏死模型，具有操作简便、结果可靠、重复性好的优点。

Establishment of a model of programmed necrosis * induced by vomit toxin in porcine intestinal epithelial cells

The invention discloses a method for establishing a model of programmed necrosis * induced by vomit toxin, which comprises the following steps: * preparation of cell culture medium; inoculation of porcine intestinal epithelial cells into cell culture medium, obtaining the cells to be induced; and adding cell culture medium containing vomit toxin into the cells to be induced. The induction cells were induced by vomit toxin, and the cell viability, lactate dehydrogenase activity, claudin 1 protein expression and mRNA expression and protein expression of the key genes of programmed necrosis were determined, and the induction of vomit toxin on porcine intestinal epithelial cells was detected * The role of programmed necrosis. The invention is based on the vomit toxin * as an inducer, and successfully establishes a programmed necrosis model of porcine intestinal epithelial cells, which has the advantages of simple operation, reliable results and good repeatability.

【技术实现步骤摘要】
呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法
本专利技术涉及细胞模型构建
，特别涉及一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法。
技术介绍
细胞程序性坏死是一种由死亡受体介导的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)非依赖性细胞死亡模式，通常在凋亡被抑制的情况下发生，死亡细胞具有明显的坏死特征。研究表明，细胞程序性坏死在缺血再灌注和炎症反应等多种因素导致的组织(如肝脏)损伤或坏死中发挥重要作用，有效抑制细胞程序性坏死对这些因素诱导的组织损伤或坏死具有重要的预防和治疗作用。肠道是机体营养物质消化吸收的重要场所，也是机体最大的免疫器官，在机体抵御病原微生物的入侵中发挥着重要作用，因此，建立肠细胞程序性坏死模型，对于研究肠道损伤机制和肠道疾病治疗具有十分重要的意义。目前常用于诱导细胞程序性坏死的诱导剂包括融合蛋白、病毒转染系统和黍子籽粒蛋白，但是其中涉及复杂的诱导剂制备过程，包括构建载体、转染、诱导等许多步骤，以及涉及脱盐、阳离子交换层析和凝胶层析等繁琐步骤获得纯化蛋白的制备过程，因此，利用此类诱导剂构建细胞程序性坏死模型存在步骤繁琐或效果不稳定的缺点。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，旨在使猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的构建操作简便且效果稳定可靠。为实现上述目的，本专利技术提出一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，包括以下步骤：配制细胞培养液；将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养，获得待诱导细胞；向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞；测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin-1蛋白表达以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用。优选地，配制细胞培养液的步骤，具体包括：向DMEM/F-12培养基中加入5％的胎牛血清、1％的青链霉素混合液、1％的谷氨酰胺、0.1％的转铁蛋白以及5μg/L的表皮细胞生长因子，混合后制得细胞培养液。优选地，将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养后，获得待诱导细胞的步骤，包括：将猪小肠上皮细胞接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞；对所述培养细胞进行传代培养至细胞传代至2～3代，获得待诱导细胞。优选地，将猪小肠上皮细胞接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞的步骤，具体包括：取冻存的猪小肠上皮细胞在37℃水浴中复苏后，按3～4×105个/mL的接种量接种至含有细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞，其中，所述培养箱的培养条件设置为：CO2的体积浓度为5％、培养温度为37℃、培养时长为2～3天，每隔20～26h更换一次细胞培养液。优选地，对所述培养细胞进行传代培养至细胞传代至2～3代，获得待诱导细胞的步骤中：所述传代培养的培养时间为7～8天。优选地，向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞的步骤中：所述含有呕吐毒素的所述细胞培养液中，呕吐毒素的浓度为0.2～2μg/mL，诱导时长为24～72h。优选地，向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞的步骤，具体包括：将所述待诱导细胞接种至孔板中，加入所述细胞培养液进行培养至细胞贴壁且长到70～80％后，再向孔板中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞。优选地，将待诱导细胞接种至孔板中，加入细胞培养液继续培养的步骤中：所述待诱导细胞接种至所述孔板中的接种量为3～4×104个/mL，所述细胞培养液在所述孔板中的添加量为80～120μL/孔。优选地，测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin-1蛋白表达、以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用的步骤中：所述程序性坏死关键基因包括受体相互作用蛋白1、受体相互作用蛋白3和混合系列蛋白激酶结构域样蛋白。本专利技术提供的技术方案中，以呕吐毒素为诱导剂、以猪小肠上皮细胞为模型细胞建立细胞程序性坏死模型，具有诱导剂来源广泛、成本低廉，且操作简便、效果稳定可靠的优点，该细胞程序性坏死模型的建立为研究肠道疾病的预防或治疗、以及相关药物的研究和开发应用提供了一条重要途径。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本专利技术提出一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，所述呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法包括以下步骤：步骤S10、配制细胞培养液；其中，在本专利技术技术方案中，所述细胞培养液是针对猪小肠上皮细胞的培养而配制的。在本专利技术的一实施例中，步骤S10具体包括：向DMEM/F-12培养基(美国HyClone公司)中加入5％的胎牛血清(美国Gibco公司)、1％的青链霉素混合液(美国HyClone公司)、1％的谷氨酰胺(美国Gibco公司)、0.1％的转铁蛋白(美国Gibco公司)以及5μg/L的表皮细胞生长因子(美国Gibco公司)，混合后制得细胞培养液。具体操作时，可将如上述比例的各个组分混合均匀后置于75cm2的培养瓶中，并分装备用。步骤S20、将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养，获得待诱导细胞；肠道是机体营养物质消化吸收的重要场所，也是机体最大的免疫器官，在机体抵御病原微生物的入侵中发挥着重要作用。目前常用于建立细胞程序性坏死模型的模型细胞有肿瘤细胞、人淋巴细胞和软骨细胞，而对于使用肠细胞建立细胞程序性坏死模型的方法尚未有明确报道。因此，建立肠细胞程序性坏死模型，对于研究肠道损伤机制和肠道疾病治疗具有十分重要的意义。本专利技术中选用猪小肠上皮细胞(Intestinalporcineepithelialcells，IPEC-1，)作为模型细胞。步骤S30、向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞；在实际生产中，谷物类饲料由于保存方式不当，常常容易发生霉变，而霉变饲料中所含有的有毒物质，即霉菌毒素，包括玉米赤霉烯酮、麦角毒素和呕吐毒素等。呕吐毒素，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，化学名为3α,7α,15一三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，属单端孢霉烯族化合物。由于它可以引起猪的呕吐而得名，对人体有一定危害作用，欧盟分类标准为三级致癌物。猪小肠上皮细胞作为吸收部位，极易受到DON的影响，引起肠道结构和功能的损伤。研究发现，DON刺激会抑制猪肠道的免疫功能，引起猪肠绒毛萎缩、溶解，影响肠道营养物质转运，抑制机体对葡萄糖的利用和肠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：配制细胞培养液；将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养，获得待诱导细胞；向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞；测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin‑1蛋白表达以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用。

【技术特征摘要】
1.一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：配制细胞培养液；将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养，获得待诱导细胞；向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞；测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin-1蛋白表达以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用。2.如权利要求1所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，配制细胞培养液的步骤，具体包括：向DMEM/F-12培养基中加入5％的胎牛血清、1％的青链霉素混合液、1％的谷氨酰胺、0.1％的转铁蛋白以及5μg/L的表皮细胞生长因子，混合后制得细胞培养液。3.如权利要求2所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养后，获得待诱导细胞的步骤，包括：将猪小肠上皮细胞接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞；对所述培养细胞进行传代培养至细胞传代至2～3代，获得待诱导细胞。4.如权利要求3所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，将猪小肠上皮细胞接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞的步骤，具体包括：取冻存的猪小肠上皮细胞在37℃水浴中复苏后，按3～4×105个/mL的接种量接种至含有细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞，其中，所述培养箱的培养条件设置为：CO2的体积浓度为5％、培养温度为37℃、培养时长为2～3天，每隔2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉兰，康萍，秦琴，王树辉，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42