一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法技术

本发明专利技术提供了一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法，其特征在于，在人类卵母细胞常规培养液中加入中药单体制备体外受精培养液，来提高人类体外受精胚胎发育率。其中，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种，所述的中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比（或体积比）范围为6.0ug/mL、2.0 ug/mL和3.0ug/mL。本发明专利技术通过研究标明，在常规培养液中加入中药单体成份黄芩苷制备的受精液，对人类卵母细胞胚胎发育具有良好的促进作用，在卵裂率和囊胚发育率等方面均好于未加中药成分的对照组。

A method to improve the development rate of human embryos in vitro fertilization

The invention provides a method for improving the embryo development rate of human in vitro fertilization, which is characterized in that a traditional Chinese medicine monomer is added to the conventional culture medium of human oocyte to prepare the in vitro fertilization culture medium so as to improve the embryo development rate of human in vitro fertilization. Among them, the Chinese medicine monomer is any of baicalin, icariin and ligustrazine, and the mass ratio (or volume ratio) of the Chinese medicine monomer to the conventional culture medium of human oocytes ranges from 6.0 ug/mL, 2.0 ug/mL and 3.0 ug/mL. The invention shows that the fertilized sperm prepared by adding baicalin, a Chinese medicine monomer, into the conventional culture medium has a good promoting effect on the development of human oocyte embryos, and is superior to the control group without Chinese medicine in the aspects of cleavage rate and blastocyst development rate.

【技术实现步骤摘要】
一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法
本专利技术属于再生医学领域，具体涉及一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法。
技术介绍
受精-胚胎移植(IVF-ET)又称“试管婴儿”，是将体内来源的精子和卵子在试管内发育成受精卵，然后再移植回母体子宫，以达到受孕目的的一种技术。是人类辅助生殖技术的主要手段。IVF技术经历了30多年的发展，使得哺乳动物卵母细胞的成熟、受精以及胚胎的发育可在体外更加直观的进行研究，并得到了广泛的应用，为不孕不育症患者获得健康的后代作出了巨大贡献。人类医学界著名的“胎源假说”认为：辅助生殖技术解决了人类诸多生育问题，但体外培养过程人为地引入了大量非生理性的操作，在生命形成过程的初始阶段，最关键、最易受外界影响的受精和胚胎早期发育阶段对生殖过程进行干预，势必会对配子和胚胎发育造成一定的影响。由于体内外发育环境的较大差异，体外培养条件的不适宜，使得人类体外受精(IVF)胚胎体外发育效率及质量远低于体内胚胎。迄今为止，体外受精胚胎的发育率仍然是亟待解决的问题，这主要与卵母细胞体外成熟质量密切相关。目前，体外受精技术主要采用完全成熟的卵母细胞，卵母细胞体外成熟是胚胎体外生产过程的关键环节，因为它决定卵母细胞的质量，影响胚胎的发育。而且人类卵母细胞体外成熟(IVM)体系仍不完善，导致人类卵母细胞的体外成熟质量不高、胚胎发育受阻，制约了其在生殖医学上的研究。另体外受精胚胎的体外培养也是IVF技术的一个关键环节，也是卵母细胞体外成熟和体外受精技术最终效果的体现和检验。在体外受精后，受精卵在向囊胚发育过程中将需经历一系列重要的变化，包括合子的形成、第一次卵裂、胚胎基因组的激活、致密化以及形成囊胚。这一过程中，外界环境的变化会导致基因表达发生改变，从而影响胚胎的正常发育及质量。目前，哺乳动物早期胚胎的体外培养研究主要集中在改善培养液成分以满足不同发育阶段的胚胎营养需求。近年来，诸多研究进展证明，中药单体成分有利于促进人类IVF胚胎体外发育，在卵母细胞成熟率、囊胚发育率、胚胎孵化率、孵化胚胎细胞数目和胚胎移植后出生率、成活率及移植效果方面都有显著效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种添加中药单体的人类卵母细胞体外受精液，以研究黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪对人类体外受精胚胎体外发育效果的影响。为了建立良好的人类胚胎体外培养体系，以体外成熟培养的人类卵母细胞为材料，分别研究中药单体成分黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪对人类体外受精胚胎培养效果的影响。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：在人类卵母细胞常规培养液中加入中药单体制备受精液，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种。其中，当所述的中药单体为黄芩苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比(或体积比)范围为4.5-7.5ug/mL；当所述的中药单体为淫羊藿苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比(或体积比)范围为1.25-3.0ug/mL。当所述的中药单体为川芎嗪时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比(或体积比)范围为2.0-3.5ug/mL。上述方案中，人卵母细胞常规受精液为改良Tyrode's培养液。本专利技术进一步提出了上述中药单体在制备用于提高人类体外胚胎发育的卵母细胞体外受精液中的应用，其中，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种。本专利技术提出了一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法，具体实施步骤如下：1)将卵丘卵母细胞复合体(COCs)在预平衡过的卵母细胞成熟液中培养30h。2)将培养成熟的MII卵母细胞置于添加有中药单体的卵母细胞体外受精液中，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种。3)当所述的中药单体为黄芩苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比(或体积比)范围为4.5-7.5ug/mL；当所述的中药单体为淫羊藿苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比(或体积比)范围为1.25-3.0ug/mL。当所述的中药单体为川芎嗪时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比(或体积比)范围为2.0-4.0ug/mL。4)将处理过的成熟卵母细胞与受选精子在二氧化碳培养箱中共孵育。5)将受精卵洗涤后，转到预平衡的胚胎培养液中，置于二氧化碳培养箱中培养待移植。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过在体外受精液中添加中药单体成分黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪，结果证明这些成分对人类胚胎发育具有良好的促进作用，在卵裂率和囊胚发育率等方面均好于未加中药单体的对照组。本试验中黄芩苷添加组能显著提高人类体外受精胚胎发育的囊胚率，表明添加适宜浓度的中药单体成分可提高人类体外受精胚胎的发育率，这可能与中药的抗氧化、抑菌、促进细胞分裂增殖等特性有关，但其确切的调节机制还需要进一步研究。具体实施方式：以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1制备含有中药单体黄芩苷的人类卵母细胞体外受精液分别按黄芩苷与人卵母细胞常规培养液的三种质量比(体积比)4.5ug/mL，6.0ug/mL，7.5ug/mL，加入常规培养液，定容至100mL，对应试验组别为(Bai1、Bai2、Bai3)，混匀后，使用0.22μm的微孔滤膜(Millipore)抽滤后存放入4℃冰箱备用。实施例2制备含有中药单体淫羊藿苷的人类卵母细胞体外受精液分别按淫羊藿苷(Ica)与人卵母细胞常规培养液的三种质量比(体积比)1.25ug/mL，2.0ug/mL，3.0ug/mL，对应试验组别为(Ica1、Ica2、Ica3)，制备混合受精液，具体实施方式参考实施例1。实施例3制备含有中药单体川芎嗪的人类卵母细胞体外受精液分别按川芎嗪(Lig)与人卵母细胞常规培养液的三种质量比(体积比)2.0ug/mL，3.0ug/mL，4.0ug/mL，对应试验组别为(Lig1、Lig2、Lig3)，制备混合受精液，具体实施方式参考实施例1。实施例4制备的含有中药单体的人类卵细胞体外受精液用于人类体外胚胎的培养步骤一卵子准备1)使用双腔取卵针以较低的负压(约90mmHg)在B超引导下吸取卵泡中的OCCs。在37℃的热台上将已经吸取在试管中的未成熟OCCs在体式显微镜下仔细找出，并使用斜面转动法初步鉴定卵母细胞是否成熟。2)将拣出的卵丘卵母细胞复合体(COCs)在预平衡过的卵母细胞成熟液中洗三遍后，放入加有卵母细胞成熟液的四孔板中，四孔板中每孔加入700uLIVM，上覆盖300uL矿物油，于38℃、6％CO2培养箱中培养30h。3)将培养后的卵丘卵母细胞复合体(COCs)转移至1X透明质酸酶溶液中使用灭菌巴氏吸管吹打数次，使卵丘细胞疏松易剥离，再用140um口径剥卵针将卵母细胞周围的卵丘细胞小心剥除。4)在倒置显微镜下确认明显排出极体的MII卵母细胞为成熟的卵母细胞。将成熟的卵母细胞使用玻璃吸管小心转移至50uL受精滴中，每滴15枚卵母细胞，并置于含38℃、6％CO2，饱和湿度的恒温培养箱中备用。步骤二精子准备1)将原精用精子稀释液以1：4稀释，取出1mL稀释后的精液于39℃烘箱孵育30min，离心(2000r/min，5min)弃上清，用含0.2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法，其特征在于，在人类卵母细胞常规培养液中加入中药单体制备一种体外授精液，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种或多种。

【技术特征摘要】
1.一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法，其特征在于，在人类卵母细胞常规培养液中加入中药单体制备一种体外授精液，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种或多种。2.根据权利要求1所述的一种提高人类体外胚胎发育率的方法，其特征在于，所述的中药单体在制备用于提高人类体外胚胎发育的卵母细胞体外受精液中的应用，其中，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种。3.根据权利要求1所述的一种提高人类体外胚胎发育率的方法，其特征在于，当所述的中药单体为黄芩苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比（或体积比）范围为4.5-7.5ug/mL。4.根据权利要求1所述的一种提高人类体外胚胎发育率的方法，其特征在于，当所述的中药单体为淫羊藿苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比（或体积比）范围为1.25-3.0ug/mL。5.根据权利要求1所述的一种提高人类体外胚胎发育率的方法，其特征在于，当所述的中药单体为川芎嗪时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比（或体积比）范围为2.0-3.5u...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔英，隋琳琳，孔慧，隋雨新，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21