隧道磁场技术分离和富集外周血中稀有细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用隧道磁场技术分离和富集外周血中稀有细胞（胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞等）的方法，其步骤包括:（a）将包被目的稀有细胞特异性抗体或核酸适配体的磁珠加入样品外周血中孵育，使其形成细胞‑抗体或核酸适配体‑磁珠偶联物。目的细胞（胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞等)较其他血细胞携带的表面抗原数量更多或与核酸适配体的亲和力更强，从而结合更多数量的磁珠。（b）将抗体或核酸适配体磁珠孵育后的血液样品流过隧道磁场中的薄膜管，携带不同数量磁珠的细胞因其磁感应强度不同而停留在薄膜管壁的不同位置，从而达到稀有细胞（胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞等)分离的效果。（c）实施洗涤步骤，去除不携带磁珠的细胞。（d）可以在磁场保持下实施细胞的固定、染色和荧光标记；（e）向薄膜管施加负压使其形成薄膜片，固定分离后的细胞并封切两端，以便作细胞后续的鉴定分型（酶学、形态学和分子生物学检测等）。与现有技术相比，本方法简单、快速、稳定，自动化程度高，目的细胞丢失少，适用于科研与临床实验诊断。

Separation and enrichment of rare cells in peripheral blood by tunneling magnetic field technology

The present invention discloses a method for isolating and enriching rare cells (fetal nucleated red blood cells, circulating tumor cells, etc.) in peripheral blood by using tunneling magnetic field technology. The steps include: (a) adding magnetic beads of target rare cell specific antibodies or nucleic acid aptamers to the peripheral blood of a sample for incubation, so as to form cell anti-. Body or aptamer magnetic beads conjugates. Objective Cells (fetal nucleated red blood cells, circulating tumor cells, etc.) carry more surface antigens or have stronger affinity with aptamers than other blood cells, thus binding more magnetic beads. (b) Blood samples incubated with antibody or aptamer beads flow through thin-film tubes in tunneling magnetic fields. Cells carrying different numbers of magnetic beads remain in different positions on the membrane wall because of their different magnetic induction intensity, thus achieving the effect of isolation of rare cells (fetal nucleated red blood cells, circulating tumor cells, etc.). (c) washing steps were performed to remove cells that did not carry magnetic beads. (d) Cell immobilization, staining and fluorescence labeling can be performed under magnetic field; (e) negative pressure is applied to the membrane tube to form a sheet, which fixes the separated cells and closes the ends for subsequent identification and typing (enzymatic, morphological and molecular biological tests, etc.). Compared with the existing technology, the method is simple, rapid, stable, highly automated and less cell loss, which is suitable for scientific research and clinical laboratory diagnosis.

【技术实现步骤摘要】
隧道磁场技术分离和富集外周血中稀有细胞的方法
本专利技术涉及生物医学领域，特别是涉及一种利用隧道磁场分离和富集外周血中稀有细胞（胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞等)的方法。
技术介绍
人体外周血中除了红细胞、白细胞和血小板等之外,有时还可能存在一些稀有细胞，如肿瘤患者外周血中存在循环肿瘤细胞、孕妇外周血中包含胎儿有核红细胞和循环内皮细胞等。这些细胞数量稀少（1毫升血中仅含有约1-10个），却具有重要临床价值。如循环肿瘤细胞可用于肿瘤的早期诊断、预后评估、疗效评价和个体化治疗；胎儿有核红细胞因拥有完整的胎儿遗传物质，被一致认为是无创性产前基因诊断的最理想靶细胞。目前外周血中稀有细胞（胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞等)的分离和富集方法主要分为非特异性富集方法和特异性富集方法。非特异性富集方法即利用细胞本身的物理特性进行富集。特异性的富集方法是利用细胞表面特异性标志物进行富集。基于以上原理的细胞分离和富集方法多种多样，包括密度梯度离心法、细胞过滤技术、细胞粘附技术、纳米基质分离技术、流式细胞分离技术、微流控芯片技术和免疫磁珠分离技术。由于目的细胞本身的物理性质(如大小、密度和电化学性质等)与其他血液细胞存在部分重叠，非特异的富集方法很难将稀少的目的细胞从外周血中分离出来。流式细胞分选技术是利用流式细胞仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。这种方法分离纯度较高，但流式细胞仪体积大，造价昂贵，操作复杂；且分选过程中有部分细胞丢失及形态改变。微流控芯片技术是把样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。该方法所需样品量小，分离纯度较高，但其在工业化生产和微型化整合等方面还存在一些问题，且仪器及芯片造价昂贵。免疫磁珠分离技术是目前最为常用的稀有细胞分离技术，它基于抗原通过功能基团与包被在磁珠上的特异性抗体相结合，形成抗原-抗体-磁珠复合物,这种复合物具有较高的磁响应性,在磁场的作用下定向移动，使复合物与其他物质分离，而达到分离富集细胞的目的。现有的免疫磁珠分离方法通常在免疫磁珠分离柱上进行，且为提高细胞纯度需要多次冲洗（正选/负选），操作繁琐且易导致目的细胞丢失，常用的微米级磁珠还在一定程度上互相吸引挤压细胞造成了目的细胞的破坏，这些都影响免疫磁珠分离效果，造成稀有细胞分离富集存在假阴性、假阳性结果，使检测结果的特异性和灵敏度难以满足临床实际工作的需要。另一方面，有些稀有目的细胞表面特异性抗原在其他细胞中也有少量的存在，这也影响了细胞分离的纯度。因此，亟需一种操作简便，成本低廉，稳定可靠的稀有细胞分离方法以用于实验室操作及临床应用中。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种利用抗体或核酸适配体磁珠在强磁隧道中分离富集外周血中稀有细胞（胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞等)的方法。一、提供一种利用强磁隧道分选抗体或核酸适配体磁珠－细胞偶联物的装置，包括用于提供洗涤液及样品液的上游输液机构、产生强磁场的隧道装置（磁场强度在0-3T内可以自由调控）、处于强磁隧道中的细胞分选薄膜管、位于所述磁性分选机构液体流动下游的收集机构及薄膜管的负压装置。二、选择目的细胞（胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞等)特异性的抗体磁珠或核酸适配体磁珠（保证目的细胞表面特异性抗原数量与混杂细胞有较大差异），将此磁珠加入抗凝血样品中，置于混匀仪上孵育使磁珠与外周血中的细胞偶联，不同细胞因其表面抗原数量不同或与核酸适配体的亲和力不同而结合了不同数量的磁珠，从而呈现不同的磁感应强度。三、用等渗液以恒速流过强磁隧道中的薄膜管以形成持续的流动相。将抗体或核酸适配体磁珠处理过的外周血样品在等渗液流动相存在下注入薄膜管，携带不同数量磁珠的细胞因其磁感应强度不同，在强磁场的作用下吸附于薄膜管壁形成流径不同的细胞带，不携带磁珠的细胞在流动相的作用下被冲洗出薄膜管，从而达到稀有细胞分离的效果。四、必要时，可向薄膜管分别输送染色液或荧光标记物等，实现细胞的原位染色或荧光标记，以便作后续鉴定。五、向输液管路施加负压，使薄膜管变成薄膜片，封切两端，排列的细胞即如过塑一样被封存固定于薄膜片中，以备形态学、分子生物学、酶学等进一步鉴定。以上步骤按顺序连续操作，可以程序控制，精准实施。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术所用的细胞分离原理类似质谱仪，是通过细胞所携带磁珠的数量多少进行梯度分离，这拓宽了对目的细胞表面特异性抗原的选择面，提高了分离和富集后的细胞纯度。现有磁珠分离技术仅能通过细胞表面抗原的有/无进行正选或负选，而本专利技术可根据细胞表面抗原的多/少进行梯度分离，显著提高了稀有细胞的分离水平。2、现有的磁珠分离技术，经分离的磁珠细胞需洗脱于溶液中，富集效果差，这是目前技术亟需解决的问题。本专利技术分离后的稀有细胞形成细胞带富集于真空薄膜片中，磁珠不需后续处理移除，可直接进行形态学检查，显著提高了细胞类型鉴定的准确性，也便于后续检测。这是现有方法所不具备的。3、血液标本处理和操作过程简单，可在全血中特异性的捕获目的细胞，不需要像现有技术为了提高分离纯度对血液标本进行预分离、多步骤分离，这很大程度上避免了稀有细胞在操作过程中的损失及检测的假阴性。4、本专利技术所述强磁隧道装置构造简单，造价低廉，操作简单，便于工业化生产及大规模的用于实验室操作及临床应用中。具体实施方式为了使本专利技术更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1：胎儿有核红细胞（fNRBC）的分离纯化1）取成人肝素抗凝血5ml，加入100倍生理盐水稀释的脐带血样品10µl及抗体磁珠液5ml，试管置混匀仪上混合30min。说明：成人血及脐带血采集后24h内分离，所用抗体为鼠抗人转铁蛋白（CD71）单克隆抗体，磁珠为四氧化三铁纳米颗粒，直径30nm；磁珠及抗体磁珠由深圳市红莓生物科技有限公司制备。2）将强磁隧道装置的磁场强度调至2T，隧道内的管路为透明塑料薄膜管。先将薄膜管以3ml/min的恒流速度注入生理盐水作为流动相，再将10ml抗体磁珠血样以1ml/min的恒速注入流动相并全部注入薄膜管流过强磁隧道（此时薄膜管内液体总流速为4ml/min），血样注射完毕后，流动相维持流动至少3min。说明：强磁隧道装置的磁隧道为矩形隧道，尺寸为110*5*2mm（长*宽*高），隧道内磁场为直流电磁场，磁力线的方向垂直于液体流动的方向，磁场强度在0-3T恒定可调，该强磁隧道装置由深圳市红莓生物科技有限公司设计制造；隧道内塑料薄膜管的管壁为0.1mm，管内径为3mm；连接薄膜管两端的管路为医用输液管。3）停止流动相，磁场维持下以3ml/min的恒流速度依次分别输入甲醇、30%瑞氏染色液及PBS缓冲液各15ml。4）管路抽真空使薄膜管收缩形成薄膜片，熔封薄膜片的两端，剪切取出薄膜片。薄膜片置于载玻片上镜检。结果表明，1）胞浆染成红色的有核红细胞结合的磁珠最多，位于薄膜片的最左端（血样入口端），与位于右边的网织红细胞及残留的白细胞、血小板及裸磁珠等完全分离，成熟红本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用隧道磁场技术分离和富集外周血稀有细胞（胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞等)的方法，其特征在于包括以下步骤:（a）将包被稀有细胞（胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞等)特异性抗体或核酸适配体的磁珠加入人体外周血中孵育，使外周血中的稀有细胞与磁珠结合;（b）将磁珠处理过的血液样品流过隧道磁场中的薄膜管，在磁场作用下，携带不同数量磁珠的细胞停留在薄膜管壁的不同位置，从而实现排序分离;（c）向薄膜管输入洗涤液，去除不携带磁珠的细胞;（d）向薄膜管施加负压使薄膜管收缩形成薄膜片，封切两端，固定并保存分离后的细胞，以便进行后续鉴定分型。

【技术特征摘要】
1.一种利用隧道磁场技术分离和富集外周血稀有细胞（胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞等)的方法，其特征在于包括以下步骤:（a）将包被稀有细胞（胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞等)特异性抗体或核酸适配体的磁珠加入人体外周血中孵育，使外周血中的稀有细胞与磁珠结合;（b）将磁珠处理过的血液样品流过隧道磁场中的薄膜管，在磁场作用下，携带不同数量磁珠的细胞停留在薄膜管壁的不同位置，从而实现排序分离;（c）向薄膜管输入洗涤液，去除不携带磁珠的细胞;（d）向薄膜管施加负压使薄膜管收缩形成薄膜片，封切两端，固定并保存分离后的细胞，以便进行后续鉴定分型。2.根据权利要求1所述的隧道磁场技术分离和富集外周血稀有细胞（胎儿有核红细胞、循环肿瘤细胞等)...

【专利技术属性】
技术研发人员：金彩科，熊礼宽，梁卉，赵媛，
申请(专利权)人：深圳市红莓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44