一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用，对供体成纤维细胞进行5‑Aza‑CdR处理72h后发现，适宜浓度(0.25μmol/L～0.5μmol/L)的5‑Aza‑CdR可以降低供体核成纤维细胞的甲基化水平，并且提高了囊胚发育率和囊胚总细胞数，分别用不同浓度和不同时间5‑Aza‑CdR处理重构胚，统计其卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数，结果发现20nmol/L，72h为最佳处理条件。分析由于在相继对供体和重构胚进行处理后，5‑Aza‑CdR本身的药物残留及其细胞毒性会在重构胚上表现出叠加的作用，确定了分析方法以期达到最佳效果。

【技术实现步骤摘要】
一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用。
技术介绍
目前，体细胞核移植(SCNT)技术与基因组学修饰技术的有机结合，为转基因动物的生产、人类基因疾病的动物模型的研制、异种器官移植等基础生物学的研究提供了强有力的技术支撑。由于猪在解剖、组织、生理、营养代谢等方面与人类非常相似，所以被认为是人类异种器官核移植最理想的供者，于是国内外的科学家纷纷将眼光聚焦于SCNT技术与基因组修饰技术的结合。由于大家畜尤其是猪的克隆效率依然很低(1％～2％)，极大地制约了体细胞克隆猪和转基因克隆猪相关研究工作的开展。影响体细胞克隆重构胚早期发育效果的因素有很多，比如供体细胞与受体细胞生长周期的协调，核质融合的过程，以及发育到8-cell阶段后能否顺利完成核质互换，以及重构胚的DNA甲基化与去甲基化水平等均影响到体细胞核移植重构胚的正常发育。对供体细胞和重构胚进行表观遗传修饰处理可以提高核移植胚胎的发育潜能。DNA甲基转移酶抑制剂是广泛运用于体细胞中的表观遗传修饰因子，它的甲基化和去甲基化在SCNT中，对供体与受体基因组重编程具有决定性作用。5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)是不可逆的DNA甲基转移酶抑制剂，具有低剂量激活甲基化沉默基因、高剂量致细胞毒性的双重效应。它已通过美国FDA认证，是临床上常用的抗癌药物之一，同时其作为DNA甲基化酶抑制剂被人们所运用。表明用5-Aza-CdR处理供体细胞能够提高牛核移植胚胎在体外发育的潜能。但高浓度的5-Aza-CdR也已经被证实对牛核移植胚胎具有细胞毒性，而低浓度的5-Aza-CdR处理供体细胞有益于猪克隆胚胎的发育。通过研究首先利用5-Aza-CdR处理成纤维细胞供体后发现，高剂量5-Aza-CdR可以降低供体细胞和重构胚的DNA甲基化水平，但对胚胎的发育却有阻碍作用，后来发现低剂量可以达到降低甲基化水平同时提高囊胚发育的目的。5-Aza-CdR处理德保黑猪HMC重构胚，传统的分析方法无法确定5-Aza-CdR的配比浓度，无法了解其对重构胚体外发育潜能的影响。综上所述，现有技术存在的问题是：5-Aza-CdR处理德保黑猪HMC重构胚，传统的分析方法无法确定5-Aza-CdR的配比浓度；若5-Aza-CdR剂量过高可以降低供体细胞和重构胚的DNA甲基化水平，但对胚胎的发育却有阻碍作用，分析方法无法了解其对重构胚体外发育潜能的影响。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用，本专利技术是这样实现的，一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物，所述德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物为5-氮杂-2′-脱氧胞苷；所述5-氮杂-2′-脱氧胞苷浓度0.25μmol/L～0.5μmol/L；处理72h。进一步，所述5-氮杂-2′-脱氧胞苷的浓度为20nmol/L，处理72h。本专利技术的另一目的在于提供一种所述德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物在德保黑猪养殖中的应用。本专利技术对供体成纤维细胞进行5-Aza-CdR处理72h后发现，适宜浓度(0.25μmol/L～0.5μmol/L)的5-Aza-CdR可以降低供体核成纤维细胞的甲基化水平，并且提高了囊胚发育率和囊胚总细胞数，分别用不同浓度和不同时间5-Aza-CdR处理重构胚，统计其卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数，结果发现20nmol/L，72h为最佳处理条件。分析由于在相继对供体和重构胚进行处理后，5-Aza-CdR本身的药物残留及其细胞毒性会在重构胚上表现出叠加的作用，确定了分析方法以期达到最佳效果。附图说明图1是本专利技术实施例提供的5-Aza-CdR对重构胚胎体外发育影响的分析方法中不同浓度5-Aza-CdR处理重构胚后HMC囊胚的显示图。图2是本专利技术实施例提供的5-Aza-CdR对重构胚胎体外发育影响的分析方法不同浓度5-Aza-CdR处理重构胚后HMC囊胚Hoechst33342染色的显示图。图3是本专利技术实施例提供的5-Aza-CdR对重构胚胎体外发育影响的分析方法5-Aza-CdR处理重构胚不同时间后HMC囊胚Hoechst33342染色的显示图。图4是本专利技术实施例提供的5-Aza-CdR对重构胚胎体外发育影响的分析方法不同浓度5-Aza-CdR同时处理供体和重构胚后HMC囊胚Hoechst33342染色的显示图。具体实施方式为能进一步了解本专利技术的
技术实现思路
、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。下面结合试验对本专利技术的应用原理作进一步的描述。1材料与方法1.1主要试剂耗材胎牛血清(FBS)购置于Gbico公司，TCM-199粉剂、DMEM粉剂购置于美国Gbico公司，激素为eCG，hCG购置于美国Sigma公司，其余的化学试剂如无特殊说明均购置于美国SigmaAldrich公司。细胞融合仪型号：ECM2001，融合槽型号：BTX450，胚胎积聚针型号：DN-10式，卵母细胞成熟培养皿：35mm及60mm塑料平皿，去核切割刀自制，胚胎培养皿：四孔板。1.2卵母细胞的成熟培养卵巢从南宁市的屠宰场获取，装入含有双抗的生理盐水中，用保温壶在4h之内送回实验室。先用普通生理盐水把卵巢冲洗干净，然后加入预热的含双抗的生理盐水，送回胚胎室抽取卵母细胞。用10mL的注射器抽取卵巢表面2～6mm的卵泡，卵泡液放入试管中静置，弃去上清，留沉淀部分分装。挑选含有3层及以上有颗粒/卵丘细胞包被、折光性良好的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，放入成熟液中(含10IU/mLhCG+10IU/mLeCG)培养，20～22h后换成不含激素的培养液，继续培养18～20h至细胞成熟。1.3胎儿成纤维细胞的培养(组织块培养法)胎猪从南宁市屠宰场获取，置于双抗生理盐水中，4h内送回实验室。先用普通生理盐水清洗三遍，转移至无菌超净台，分离出部分大腿组织，之后用含双抗的PBS清洗2遍，放入60mm的平皿，将其剪碎至2～3mm的组织块，往培养皿中加入少量含10％FBS的DMEM培养液，用镊子将其均匀铺开，在皿盖作好标记，将其倒扣于培养箱中，4h后加入少量培养液，防止组织块漂浮。24h后在平皿底部加满培养液，48h后继续观察成纤维细胞的生长状况，待成纤维细胞生长至90％左右汇合度时，进行传代，用作猪手工克隆供体细胞。1.4卵母细胞的去核方法挑选优质的卵母细胞置于洗卵液中，吹打数次以去除颗粒细胞。然后将其移入链霉蛋白酶溶液中，透明带开始变形时，立即移入含为20％FBS的洗液(T20)中洗涤，然后放入T20中等其恢复成圆形，用玻璃吸管将卵母细胞转移至切割液(含2.5μg/mLCB)中，挑选恢复完整的卵母细胞用于去核。极体定位法：挑取第一极体完整的细胞，将极体置于6点或12点的位置，用切割刀切去极体方向约1/3的卵胞质，去核胞质留做后续试验。1.5供/受体细胞的融合/激活采用一步融合法。融合/激活分为三步，首先进行粘合，然后再进行融合/电激活，最后进行化学激活。粘合：先用植物凝集素(PHA)把无核半卵和供体细胞粘合，形成半卵-供体细胞配对物；然后再把另一个去核半卵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物，其特征在于，所述德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物为5‑氮杂‑2′‑脱氧胞苷；所述5‑氮杂‑2′‑脱氧胞苷浓度0.25μmol/L～0.5μmol/L；处理72h。

【技术特征摘要】
1.一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物，其特征在于，所述德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物为5-氮杂-2′-脱氧胞苷；所述5-氮杂-2′-脱氧胞苷浓度0.25μmol/L～0.5μmol/L；处理72h。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：吕玲燕，陆杏蓉，石德顺，陈宝剑，温斌华，谢炳坤，吴永绍，潘天彪，
申请(专利权)人：广西壮族自治区畜牧研究所，
类型：发明
国别省市：广西,45