【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种ghr基因敲除的胰岛β细胞系及其构建方法和应用。
技术介绍
1、胰岛β细胞是胰岛细胞的一种，属内分泌细胞，约占胰岛细胞总数的70％，主要位于胰岛中央部，能分泌胰岛素，起调节血糖含量的作用。胰岛β细胞功能受损，胰岛素分泌绝对或相对不足，从而引发糖尿病。
2、生长激素受体(growth hormone receptor，ghr)是一种跨膜糖蛋白，属于细胞因子受体家族。在动物体内，细胞膜表面的ghr可以与脑垂体产生的生长激素(gh)相结合，启动细胞内的信号转导机制，增加胰岛素样生长因子-1的表达，促进细胞的增殖，最终发挥调控动物骨骼肌的生长发育的作用，说明在动物生长发育过程中ghr基因发挥着重要的作用。ghr信号能调节β细胞增殖、凋亡、胰岛素分泌等过程，但分子机制仍有待探索。β细胞特异性ghr敲除(βghrko)小鼠表现为高脂饮食诱导下βghrko小鼠较对照组小鼠(ghr flox小鼠)出现明显的胰岛素分泌异常，所以构建ghr敲除的min6(ghrko min6)单克隆细胞系，对进一步验证和探究ghr信号调控胰岛β细胞生理功能的分子机制具有重要的意义。
3、因此，亟需提供一种ghr基因敲除的胰岛β细胞系及其构建方法。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种ghr基因敲除的胰岛β细胞系及其构建方法和应用，解决了问题，达到了效果。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3
4、本专利技术中利用crispr/cas9系统构建ghr敲除的min6细胞系并进行单克隆化(ghrko min6)，是研究ghr缺失对高脂喂养状态下小鼠胰岛β细胞胰岛素分泌功能的影响的重要的细胞来源。
5、上述70-80％中的具体点值可以选择70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％等。
6、优选地，所述sgrna的核酸序列包括如seq id no.1-seq id no.3所示的序列。
7、seq id no.1：gaacgacacuuggugaaucg。
8、seq id no.2：caguucaggggaacgacacu。
9、seq id no.3：ugaaaaugucuccaguucag。
10、优选地，所述小分子转染试剂包括jetprime。
11、优选地，所述细胞转染还包括：溶解质粒dna后进行离心，离心后再次加入小分子转染试剂离心静置，4-8h后更换新鲜培养基，转染48-96h后进行荧光检测。
12、上述4-8h中的具体点值可以选择4h、5h、6h、7h、8h等。
13、优选地，所述pcr扩增包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的tm值为50-70℃。
14、上述50-70℃中的具体点值可以选择50℃、55℃、60℃、65℃、70℃等。
15、优选地，所述上游引的核酸序列包括seq id no.4所示的序列；所述下游引的核酸序列包括seq id no.5所示的序列。
16、seq id no.4：cattcttttctgggatgctat。
17、seq id no.5：cggacattgcatctgtgatt。
18、优选地，所述pcr扩增产物的长度为600-1000bp；所述pcr扩增产物含有编辑位点且编辑位点左右两侧的产物片段长度相差100-200bp。
19、上述600-1000bp中的具体点值可以选择600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、900bp、1000bp等。
20、上述100-200bp中的具体点值可以选择100bp、110bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp等。
21、优选地，所述基因编辑的检测的方法包括错配酶切法。
22、第二方面，本专利技术提供了一种ghr基因敲除的胰岛β细胞系，所述胰岛β细胞系由第一方面所述的构建方法构建得到。
23、第三方面，本专利技术提供了第二方面所述的胰岛β细胞系在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
24、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术获得了能够稳定遗传的ghr基因敲除的胰岛β细胞系，为探索gh/ghr信号对胰岛β细胞分泌功能的调控机制和开发因肥胖引起的2型糖尿病的治疗手段提供实验工具。
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1.一种GHR基因敲除的胰岛β细胞系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：设计sgRNA构建CRISPR/Cas9质粒载体，培养细胞进行细胞转染，提取基因组进行基因编辑的检测，PCR扩增后进行PCR扩增产物测序及T载体连接测序；
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的核酸序列包括如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.3所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述小分子转染试剂包括jetPRIME。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述细胞转染还包括：溶解质粒DNA后进行离心，离心后再次加入小分子转染试剂离心静置，4-8h后更换新鲜培养基，转染48-96h后进行荧光检测。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的Tm值为50-70℃。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述上游引的核酸序列包括SEQ IDNO.4所示的序列；所述下游引的核酸序列包括S
7.根据权利要求1-6中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增产物的长度为600-1000bp；所述PCR扩增产物含有编辑位点且编辑位点左右两侧的产物片段长度相差100-200bp。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述基因编辑的检测的方法包括错配酶切法。
9.一种GHR基因敲除的胰岛β细胞系，其特征在于，所述胰岛β细胞系由权利要求1-8中任一项所述的构建方法构建得到。
10.权利要求9所述的胰岛β细胞系在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种ghr基因敲除的胰岛β细胞系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：设计sgrna构建crispr/cas9质粒载体，培养细胞进行细胞转染，提取基因组进行基因编辑的检测，pcr扩增后进行pcr扩增产物测序及t载体连接测序；
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述sgrna的核酸序列包括如seq idno.1-seq id no.3所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述小分子转染试剂包括jetprime。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述细胞转染还包括：溶解质粒dna后进行离心，离心后再次加入小分子转染试剂离心静置，4-8h后更换新鲜培养基，转染48-96h后进行荧光检测。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述pc...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴英杰，孙杰，刘传宇，王宁，郭美华，刘波，姜如娇，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：
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