利用低分子化合物的由成熟肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法技术

本发明专利技术提供一种由肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法，其包括：使哺乳动物的肝细胞与TGFβ受体抑制药在体外接触、以及任意地还包括使哺乳动物的肝细胞与GSK3抑制药和/或ROCK抑制药在体外接触。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用低分子化合物的由成熟肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法
本专利技术涉及利用低分子化合物的由成熟肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法、含有该低分子化合物而成的由成熟肝细胞诱导肝干细胞/前体细胞的肝干细胞/前体细胞诱导剂等。
技术介绍
干细胞生物学的进步引起对于其在肝再生医疗中的应用的极大关心，但是还没有实现这种应用。作为最受期待的细胞来源之一的人工多能性干细胞(iPS细胞)被集中研究，但是对功能性的肝细胞的有效分化是困难的，依然存在肿瘤形成危险，因此这种应用现在仍然受限。利用最近开发的方法时，甚至不能以比得上成熟肝细胞的效率产生具有使受伤的肝脏再生的能力的肝细胞(非专利文献1)。另一方面，通过最近的研究，表明能够将不同家谱的细胞直接转换(直接重编程，directreprogramming)为肝细胞样的细胞(非专利文献2及3)。尽管这种发现有希望，但是直接重编程与iPS细胞的情况同样地伴随有转基因，因此依然存在预想不到的危险，不能应用于再生医疗。最近，几个小组报告了，若肝脏受到慢性损害则成体肝细胞能够重编程为增殖性且两能性的肝干细胞/前体细胞这一令人惊讶的发现(非专利文献4及5)。这些革新的发现，不仅对于肝干细胞理论，而且对于肝再生研究提供大的洞察。即，若体外可以再现这种重编程则能够期待如此得到的肝干细胞/前体细胞成为肝再生医疗中的新的细胞来源。但是不伴随转基因地将成熟肝细胞重编程为肝干细胞/前体细胞的方法完全不为人所知。本专利技术人等、其它小组以前报告了某种低分子抑制药的组合有助于干细胞的多能性的诱导以及维持(非专利文献6及7)。但是，完全没有关于这些低分子抑制药对于由成熟肝细胞向肝干细胞/前体细胞的重编程的贡献的报告。现有技术文献非专利文献非专利文献1：Zhu,S.etal.,Nature508,93-97(2014)非专利文献2：Huang,P.etal.,Nature475,386-389(2011)非专利文献3：Sekiya,S.,andSuzuki,A.Nature475,390-393(2011)非专利文献4：Tarlow,B.D.etal.,CellStemCell15,605-618(2014)非专利文献5：Yanger,K.etal.,GenesDev.27,719-724(2013)非专利文献6：Hou,P.etal.,Science341,651-654(2013)非专利文献7：Kawamata,M.andOchiya,T.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107,14223-14228(2010)
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的目的在于，提供不伴随转基因地、有效地将成熟肝细胞重编程为肝干细胞/前体细胞的方法。用于解决问题的方案本专利技术人等为了达成上述目的而进行深入研究，结果发现，若在TGFβ受体抑制药的存在下培养哺乳动物的成熟肝细胞则能够将该细胞重编程为增殖性且能够分化为肝细胞和胆管上皮细胞中的任意一种的两能性的细胞。进而，通过使TGFβ受体抑制药组合糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制药或Rho激酶(ROCK)抑制药来使用，成功改善了重编程效率。重编程效率改善效果通过在TGFβ受体抑制药组合GSK3抑制药而变得显著。可知组合使用TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药这三种药剂的情况，与组合TGFβ受体抑制药和GSK3抑制药的情况，在重编程效率方面没有发现大的差异，但是组合使用三种药剂时细胞的增殖能力优异。如此得到的源自成熟肝细胞的肝干细胞/前体细胞，若移植到存在慢性肝损伤的免疫缺陷小鼠则表现出与成熟肝细胞同等的肝再生能力。本专利技术人等基于这些发现进一步重复研究，结果完成了本专利技术。即，本专利技术如以下所述。(1)一种由肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法，其包括：使哺乳动物的肝细胞在体外与TGFβ受体抑制药接触。(2)根据(1)所述的方法，其还包括：使GSK3抑制药和/或ROCK抑制药在体外与前述肝细胞接触。(3)根据(1)所述的方法，其还包括：使GSK3抑制药和ROCK抑制药在体外与前述肝细胞接触。(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，前述肝细胞与前述TGFβ受体抑制药的接触通过在该抑制药的存在下对该肝细胞进行培养来实施。(5)根据(2)～(4)中任一项所述的方法，其中，前述肝细胞与前述GSK3抑制药和/或前述ROCK抑制药的接触通过在该抑制药的存在下对该肝细胞进行培养来实施。(6)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，哺乳动物为人、大鼠或小鼠。(7)一种由肝细胞诱导肝干细胞/前体细胞的肝干细胞/前体细胞诱导剂，其是含有TGFβ受体抑制药而成的。(8)根据(7)所述的诱导剂，其是GSK3抑制药和/或ROCK抑制药组合而成的。(9)根据(7)所述的诱导剂，其是GSK3抑制药和ROCK抑制药组合而成的。(10)根据(7)～(9)中任一项所述的诱导剂，其中，肝细胞源自人、大鼠或小鼠。(11)一种源自哺乳动物的肝细胞的肝干细胞/前体细胞，其具有以下的特征：(a)具有自身再生能力，(b)能够分化为肝细胞和胆管上皮细胞这两者，(c)作为表面抗原标记物，表达EpCAM，但是不表达Dlk1。(12)根据(7)～(10)中任一项所述的诱导剂，其被用作通过(1)～(6)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞的维持/扩增剂。(13)一种细胞的维持/扩增方法，其特征在于，其为通过(1)～(6)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞的维持/扩增方法，(i)第1继代直至第4继代为止在用胶原或基质胶涂覆的培养容器上，(ii)第5继代及以后在用基质胶涂覆的培养容器上，在TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药的存在下对该肝干细胞/前体细胞进行继代培养。(14)一种胆管上皮细胞的诱导方法，其为由通过(1)～(6)及(13)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞诱导胆管上皮细胞的方法，其包括：(i)在低密度的饲养细胞上，在TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药的存在下对该肝干细胞/前体细胞进行培养的工序；和(ii)将工序(i)中得到的细胞在含有基质胶的培养基中进一步培养的工序。(15)一种评价方法，其为评价被检化合物在哺乳动物体内的代谢的方法，其包括：(i)使由通过(1)～(6)及(13)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞分化诱导而得到的肝细胞与被检化合物接触的工序；和(ii)测定该肝细胞中的被检化合物的代谢的工序。(16)一种评价方法，其为评价被检化合物对于哺乳动物的肝毒性的方法，其包括：(i)使由通过(1)～(6)及(13)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞分化诱导而得到的肝细胞与被检化合物接触的工序；和(ii)测定该肝细胞的损伤的有无或其程度的工序。(17)一种肝损伤改善剂，其是含有通过(1)～(6)及(13)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞而成的。(18)一种肝损伤的改善方法，其为哺乳动物的肝损本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种由肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法，其包括：使哺乳动物的肝细胞在体外与TGFβ受体抑制药接触。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.08 JP 2016-0030881.一种由肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法，其包括：使哺乳动物的肝细胞在体外与TGFβ受体抑制药接触。2.根据权利要求1所述的方法，其还包括：使GSK3抑制药和/或ROCK抑制药在体外与所述肝细胞接触。3.根据权利要求1所述的方法，其还包括：使GSK3抑制药和ROCK抑制药在体外与所述肝细胞接触。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述肝细胞与所述TGFβ受体抑制药的接触通过在该抑制药的存在下对该肝细胞进行培养来实施。5.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，其中，所述肝细胞与所述GSK3抑制药和/或所述ROCK抑制药的接触通过在该抑制药的存在下对该肝细胞进行培养来实施。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，哺乳动物为人、大鼠或小鼠。7.一种由肝细胞诱导肝干细胞/前体细胞的肝干细胞/前体细胞诱导剂，其是含有TGFβ受体抑制药而成的。8.根据权利要求7所述的诱导剂，其是GSK3抑制药和/或ROCK抑制药组合而成的。9.根据权利要求7所述的诱导剂，其是GSK3抑制药和ROCK抑制药组合而成的。10.根据权利要求7～9中任一项所述的诱导剂，其中，肝细胞源自人、大鼠或小鼠。11.一种源自哺乳动物的肝细胞的肝干细胞/前体细胞，其具有以下的特征：(a)具有自身再生能力，(b)能够分化为肝细胞和胆管上皮细胞这两者，(c)作为表面抗原标记物，表达EpCAM，但是不表达Dlk1。12.根据权利要求7～10中任一项所述的诱导剂，其被用作通过权利要求1～6中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或权利要求11所述的肝干细胞/前体细胞的维持/扩增剂。13.一种细胞的维持/扩增方法，其特征在于，其为通过权利要求1～6中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或权利要求11所述的肝干细胞/前体细胞的维持/扩增方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：落谷孝广，胜田毅，
申请(专利权)人：国立研究开发法人国立癌症研究中心，CYNITY株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP