一种在低氧条件下体外扩增人血管内皮祖细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种在低氧条件下体外扩增人血管内皮祖细胞的方法，包括从人骨髓中分离出EPCs，并在低氧条件下于培养箱中培养，其中，所述低氧条件为1％O2的低氧条件；所述低氧条件对EPCs基因表达包括多种基因的差异表达，并至少涉及以下生物过程：细胞对脂肪酸的反应、调节有丝分裂细胞周期转变的泛素‑蛋白连接酶活性的正调控等。本发明专利技术的培养方法相比于常氧培养，低氧环境与骨髓微环境更为相似，更有利于EPCs保持其原有的特性；本发明专利技术对不同培养方法导致的EPCs中基因表达的改变进行分子水平的评价，给出了低氧或缺氧条件对细胞干性影响的差异表达基因与差异表达基因的分子途径，并用于改善目前的干细胞的培养方法。

A method for amplifying human endothelial progenitor cells in vitro under hypoxic conditions

The present invention provides a method for in vitro expansion of human vascular endothelial progenitor cells under hypoxic conditions, including isolating EPCs from human bone marrow and culturing them in incubator under hypoxic conditions, in which the hypoxic condition is 1% O 2, and the differential expression of EPCs genes under the hypoxic condition. It involves at least the following biological processes: cell response to fatty acids, positive regulation of ubiquitin-protein ligase activity regulating mitotic cell cycle transition, etc. Compared with the normal oxygen culture, the hypoxic environment is more similar to the bone marrow microenvironment, which is more conducive to maintaining the original characteristics of EPCs. The present invention evaluates the changes of gene expression in EPCs caused by different culture methods at the molecular level, and gives the differential expression of the effects of hypoxic or hypoxic conditions on cell dryness. The molecular pathways of genes and differentially expressed genes are used to improve the current method of stem cell culture.

【技术实现步骤摘要】
一种在低氧条件下体外扩增人血管内皮祖细胞的方法
本专利技术属于医药生物领域，具体涉及一种在低氧条件下体外扩增人血管内皮祖细胞的方法。
技术介绍
骨髓含有能够迁移到外周血并分化成为成熟内皮细胞的祖细胞，被称为血管内皮祖细胞(Endothelialprogenitorcells，EPCs)，其为血管内皮细胞的前体细胞，主要存在于脐带血、成人外周血、骨髓。内皮祖细胞与造血干细胞来自共同的中胚层前体细胞血液血管母细胞，在生理或病理因素刺激下，可以从骨髓动员到外周血中参与损伤血管的修复，而脐血中的内皮祖细胞起源于胎儿的肝脏。近年来的研究显示血管内皮祖细胞(EPCs)已被证明对多种血管病变有治疗作用，在心脑血管疾病、外周血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用，例如：a.促进血管新生的作用，改善脏器缺血导致的功能障碍，EPCs的体内回输可用来治疗人体缺血性疾病：如缺血性心脏病、脑缺血、肾缺血、肢端缺血坏死等一系列疾病，尤其将在心肌梗死、心绞痛等缺血性心脏病的治疗过程中起到巨大作用；b.帮助修复损伤的血管内膜，如经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)和其他血管的介入手术不可避免的多少会损伤血管内膜，EPCs的回输将促进损伤内膜的修复，减少因内膜损伤而导致的介入术后的血管再狭窄；c.帮助恢复和重建动脉粥样硬化的血管内皮功能，防止动脉粥样硬化的进一步恶化，减少心肌梗死的发生；d.在肿瘤学方面，通过研究EPCs在肿瘤血管生成过程中的作用，采取相应的抑制措施，为抑制肿瘤血管生成以及抑制肿瘤生长开辟新途径。同时，因其可分化为表达FVIII的血管内皮细胞，可作为一种细胞治疗途径用于FVIII缺乏的甲型血友病。但是由于能从骨髓中分离的EPCs极少，所以有必要进行体外扩增。EPCs位于骨髓的低氧微环境中。然而，基本上所有的EPCs的研究都是在非生理环境空气中处理的细胞进行的。而且，虽然内皮祖细胞的培养技术可以获得一定数量供科研需要，但还无法实现较大规模生产的需求，并且不能充分保持祖细胞的干性。因此，本领域亟待提高扩增的效率并同时保留祖细胞的干性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种在低氧条件下体外扩增人血管内皮祖细胞的方法，包括从人骨髓中分离出EPCs，并在低氧条件下于培养箱中培养。优选地，本专利技术所述的扩增人血管内皮祖细胞的方法中，所述低氧条件为1％O2的低氧条件。优选地，本专利技术所述的扩增人血管内皮祖细胞的方法中，所述培养EPCs的培养基为EBM-2培养基。优选地，本专利技术所述的扩增人血管内皮祖细胞的方法中，所述培养EPCs的时间为21天左右。本专利技术的另一方面在于，通过提供上述扩增人血管内皮祖细胞的方法，专利技术人发现所述低氧条件对EPCs基因表达包括以下基因的差异表达：下调基因LOC102723946、C1QC、TYROBP、PNLIPRP3、MMP10、FOLR3、VSIG4、DCDC2C、F13A1、SERPINB4、IVL、ADORA3、LINC00520、LONRF3、EPHB1、FCGR3A、MRC1、LOC284561、PPM1L、TFEC、COBL、SIGLEC1、GPRC5C、POSTN、TFPI2、KYNU、PID1、PDK4、AKR1C2、FAM84A、GDF15、CXCL5、TFRC、IGFBP3；上调基因RP11-909M7.3、PAPL、PIK3R6、TCTEX1D1、PLK1、PIP、MVD、CDC20、CCNB1、PRKCDBP、HMGCS1、SCUBE3、UBE2C、EBP。优选地，本专利技术所述的扩增人血管内皮祖细胞的方法中，所述差异表达基因至少涉及以下生物过程：细胞对脂肪酸的反应、调节有丝分裂细胞周期转变的泛素-蛋白连接酶活性的正调控、乙酰辅酶A代谢过程以及调节有丝分裂的细胞周期相变。优选地，本专利技术所述的扩增人血管内皮祖细胞的方法中，所述差异表达基因的表达至少与KEGG途径相关：脂质代谢、p53信号传导途径、萜类和聚酮化合物代谢、补体和凝血级联和细菌(百日咳)。优选地，本专利技术所述的扩增人血管内皮祖细胞的方法中，所述差异表达基因的蛋白质相互作用网络中评分≥0.9的相互作用包括PLK1-CDC20，PLK1-CCNB1，CDC20-CCNB1，UBE2C-CDC20，MVD-HMGCS1，UBE2C-PLK1，CXCL5-ADORA3。本专利技术与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：干细胞的干性主要表现为细胞的自我更新和分化的能力。目前广泛采用的EPCs培养方法是在“5％CO2，95％空气”的常规培养箱下进行培养并扩增(氧气浓度～20％)，这种在空气中培养被认为是“常氧”，然而专利技术人发现传统常氧培养对于EPCs来说是极度高氧的；高氧对于EPCs的危害在于：细胞在有氧代谢时因氧化应激产生的活性氧簇(ROS)会损伤细胞的DNA，造成遗传的不稳定性。因此，本专利技术提供了一种在保持干细胞的干性同时能够有效增加EPCs体外扩增的方法。意外地，本专利技术的培养方法相比于常氧培养，低氧(缺氧)环境与骨髓微环境更为相似，更有利于EPCs保持其原有的特性。另一方面，本专利技术通过对不同培养方法导致的EPCs中基因表达的改变进行分子水平的评价，给出了低氧或缺氧条件对细胞干性影响的差异表达基因与差异表达基因的分子途径，并用于改善目前的干细胞的培养方法。附图说明图1为本专利技术的一个实施例中的常氧(20％O2)以及低氧(1％O2)条件下对EPCs的增殖能力影响图；图2为本专利技术的一个实施例中的1％O2条件培养增强EPCs成血管及迁移能力图；图3为本专利技术的一个实施例中的使用软件处理DEGs的GeneOntology分析图；图4为本专利技术的一个实施例中的DEGs的蛋白质相互作用网络(PPI)图；图5为本专利技术的一个实施例中的DEGs的生物信息学GO聚类分析示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1低氧条件下体外扩增人血管内皮祖细胞1.从人骨髓中分离出EPCs，并在不同氧浓度下进行培养。在获得知情同意后，从3名志愿者中获得骨髓。使用人外周血淋巴细胞分离液(TBD，货号：LTS1077)从骨髓中分离骨髓单个核细胞(MNC)，并以4×105个细胞/cm2接种于纤维粘连蛋白(BD，货号：354008)包被的25cm2易用培养瓶(NUNC，货号：156367)中。培养血管内皮祖细胞的培养基为EGM-2培养基，然后将培养瓶分别置于37℃，5％CO2，1％O2(低氧)或20％O2(常氧)条件下进行培养。EGM-2培养基为套装，包含500mLEBM-2基础培养基并添加0.5mLhEGF(人重组表皮生长因子)、0.2mlHydrocortisone(氢化可的松)、2.0mLhFGF-B(人成纤维细胞生长因子基本与肝素)、0.5mLVEGF(血管内皮生长因子)、0.5mLR3-IGF-1(人重组胰岛素样生长因子)、0.5mL抗坏血酸、0.5mLGA-1000(庆大霉素，两性霉素-B)、0.5mL肝素、10mLFBS(胎牛本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在低氧条件下体外扩增人血管内皮祖细胞的方法，包括从人骨髓中分离出EPCs，并在低氧条件下于培养箱中培养。

【技术特征摘要】
1.一种在低氧条件下体外扩增人血管内皮祖细胞的方法，包括从人骨髓中分离出EPCs，并在低氧条件下于培养箱中培养。2.根据权利要求1所述的扩增人血管内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述低氧条件为1％O2的低氧条件。3.根据权利要求1所述的扩增人血管内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述培养EPCs的培养基为EGM-2培养基。4.根据权利要求1所述的扩增人血管内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述培养EPCs的时间为21天左右。5.根据权利要求1所述的扩增人血管内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述低氧条件对EPCs基因表达包括以下基因的差异表达：下调基因LOC102723946、C1QC、TYROBP、PNLIPRP3、MMP10、FOLR3、VSIG4、DCDC2C、F13A1、SERPINB4、IVL、ADORA3、LINC00520、LONRF3、EPHB1、FCGR3A、MRC1、LOC284561、PPM1L、TFEC、COBL、SIGLEC1、GPRC5C、POSTN、TFPI2、KYNU、PID1、PDK4、AKR1C2、FAM84A、...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈镇洲，林依秋，刘兵，钟健，冯卓威，
申请(专利权)人：广州赛琅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44