蛋白质纯化制造技术

本发明专利技术涉及一种纯化蛋白质的方法，包括半连续色谱步骤，由此收集流出物并将其重新装载到色谱基质上。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白质纯化专利
：本专利技术属于蛋白质纯化领域。更具体地，本专利技术涉及使用半连续色谱步骤，纯化目标蛋白质如抗体或抗体片段的方法。专利技术背景：蛋白质的大规模经济纯化越来越成为生物技术产业的重要问题。通常，蛋白质通过细胞培养生产，其中通过插入含有该蛋白质基因的重组质粒，使用经过工程改造的哺乳动物或细菌细胞系来生产目标蛋白质。由于所使用的细胞系是活生物体，因此必须喂养含有糖、氨基酸和生长因子的复杂生长培养基。目标蛋白质必须从供给细胞的化合物混合物和从细胞本身的副产物(进料流)中分离到足以用作人治疗剂的纯度。卫生当局为用于人类施用的蛋白质设定的关于来自进料流的杂质的标准非常高。本领域已知的许多蛋白质纯化方法包含需要应用例如低pH或高pH、高盐浓度或其他可能不可逆地危害待纯化蛋白质的生物活性的极端条件的步骤，从而不合适。因此，将所需蛋白质分离至足够的纯度构成了艰巨的挑战。历史上，蛋白质纯化方案已经基于待纯化蛋白质和不需要的蛋白质污染物之间的大小、电荷和溶解度的分子性质的差异进行预期。基于这些参数的方案包括尺寸排阻色谱、离子交换色谱、差异沉淀等。抗体和抗体片段在一系列治疗领域中变得越来越重要。产生抗体和抗体片段的最重要方法之一是通过重组技术。这些技术使用宿主细胞来表达所需的抗体或，然后将其从生产培养基中分离并纯化。抗体需要糖基化，并因此通常在使用真核细胞的真核表达系统中表达，特别是哺乳动物细胞如CHO、PER.C6、NS0、BHK或Sp2/0细胞。在真核表达系统中，表达的目标蛋白质如抗体通常被分泌到细胞培养基中。随后可以容易地将培养基与分泌蛋白质的细胞分离，例如，通过离心或过滤。几乎所有目前的工业抗体纯化平台都使用蛋白A。蛋白A是在细菌金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的细胞壁中发现的细胞表面蛋白，其与哺乳动物免疫球蛋白的Fc部分结合。蛋白A对人IgG1和IgG2抗体具有高亲和力，对人IgM、IgA和IgE抗体具有中等亲和力。因此，蛋白A纯化不适用于缺乏Fc部分的抗体片段。亲和色谱基于目标蛋白质(或一组蛋白质)与偶联于色谱基质的特定配体之间的可逆相互作用来分离蛋白质。目标蛋白质和偶联于色谱基质的配体之间的相互作用可以是静电或疏水相互作用、范德华力和/或氢键合的结果。为了从亲和介质中洗脱靶分子，可以逆转相互作用，例如通过使用竞争性配体特异性地进行，或通过改变pH、离子强度或极性而非特异性地进行。亲和纯化需要可以共价连接到色谱基质上的配体。偶联的配体必须保持其对靶分子的特异性结合亲和力，并且在洗去未结合的物质后，配体和靶分子之间的结合必须是可逆的，以允许靶分子以活性形式被取出。尽管其常用，但亲和色谱是昂贵的，特别是在纯化治疗性蛋白质所必需的工业规模上。离子交换色谱可用于纯化可电离的分子。离子化的分子基于其带电基团与附着于固相支持基质的带相反电荷的分子的非特异性静电相互作用，从而延迟那些与固相更强烈相互作用的离子化的分子而分离。每种离子化的分子的净电荷及其对基质的亲和力根据带电基团的数量、每个基团的电荷以及竞争与带电固相基质相互作用的分子的性质而变化。这些差异导致通过离子交换色谱分辨各种分子类型。通常通过增加缓冲液的离子强度(即电导率)以与溶质竞争离子交换基质的带电位点来实现对与固相结合的分子的洗脱。改变pH值并从而改变溶质的电荷是实现对溶质洗脱的另一种方法。电导率或pH的变化可以是逐渐的(梯度洗脱)或逐步的(分步洗脱)。已知两种一般类型的相互作用：由带负电荷的氨基酸侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)与带正电荷的表面相互作用所介导的阴离子交换色谱以及由带正电荷的氨基酸残基(例如赖氨酸和精氨酸)与带负电的表面相互作用所介导的阳离子交换色谱。阴离子交换剂可分为弱或强。弱阴离子交换剂上的电荷基团是弱碱，其变为去质子化，并因此在高pH失去其电荷。二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素是弱阴离子交换剂的一个实例，其中氨基可以在pH～9以下带正电荷并且在更高pH值逐渐失去其电荷。DEAE或二乙基-(2-羟基-丙基)氨基乙基(QAE)具有例如氯作为抗衡离子。通过增加洗脱缓冲液的离子强度来洗脱的替代方法(洗脱色谱)是使用对固定相具有比对结合蛋白更高的动态亲和力的分子进行洗脱。这种进行离子交换色谱的方式称为置换色谱。置换色谱与任何其他色谱模式根本不同之处在于溶质在流动相改性剂中不被解吸并且通过迁移速率的差异而分离。在置换中，分子通过置换剂分子的前进冲击波被迫向下迁移到色谱柱，所述置换剂分子对固定相具有比来自进料流的任何组分更高的亲和力。与其他操作模式相比，正是这种强制迁移导致更高的产品浓度和纯度。保留率高，然后将置换剂溶液持续注入柱子中。用于各种色谱技术，特别是用于大的工业规模的纯化方法的色谱基质非常昂贵。它们通常在清洁后重复使用。由于所用清洁剂的苛刻性质，色谱基质效率随时间降低。通常，本领域不能非常有效地使用色谱基质，因为未充分利用它们的全部最大蛋白质结合能力。在本领域中，使用色谱基质，使得它们装载低于其全部容量的目标蛋白质以提高产率。当蛋白质基质装载目标蛋白质至其全部容量时，许多目标蛋白质将丢失在流出物中。由于色谱基质的高成本和有限的寿命，本领域需要最佳地使用色谱基质的方法。来自大规模细胞培养方法的粗制蛋白质制备物通常不能在单个纯化循环中被纯化。由于待纯化的蛋白质的量，需要相同纯化过程的几个循环来纯化细胞培养物的输出。因此，待纯化的蛋白质混合物经常在多个纯化循环中逐批纯化，也包括多个色谱循环。在生物制药的大规模制造过程中也实施了连续过程。在连续色谱中，根据方法要求，将多个相同的柱连接成允许柱串联和/或平行操作的布置。与单柱或分批色谱(其中单个色谱循环基于几个连续步骤，例如装载、洗涤、洗脱和再生)相比，在基于多个相同色谱柱的连续色谱中，所有这些步骤同时发生，但各自在不同的柱上发生。连续色谱操作可以更好地利用色谱树脂，缩短处理时间并降低缓冲液要求，所有这些都有利于过程经济性。操作连续色谱的一种具体方式称为模拟移动床(SMB)色谱。在模拟移动床色谱中，包括该系统的所有色谱柱周期性地同时在与样品流相反的方向上移动。通过适当重新引导进/出柱的入口和出口流来实现柱的移动，这需要复杂的设置。本领域已经描述了半连续色谱，其中不使用单个大的色谱柱，而是在行中使用多个较小的柱子并装载至更高的结合容量。将每个柱的流出物直接装载到下一个柱子上。备选地，将第一柱子的流出物引导回第一容器，其中包含具有目标蛋白质的混合物，然后重新装载到第一柱子上(Mahajan，George等人，2012)。在行中使用多个色谱柱需要复杂的流控制设备和控制软件，以及额外的色谱硬件，包括泵、阀门、检测器和每个附加柱子的外壳，这增加成本，增加部件故障的可能性，增加验证过程的复杂性并使错误诊断复杂化。此外，为了将来自一个柱子的流出物对准到相邻接收柱子的序列中的正确时段，必须引入延迟时段使得它们匹配，这降低了操作速度。由于每个附加接收柱子必须以交错顺序启动和停止，导致柱子在这些时段内处于非活动状态，因此每次关闭或重新启动操作时都会产生额外的生产率损失。因此，本领域仍需要简单的、有效率的且成本有效的蛋白质纯化方法，包括使用色谱基质。专利技术概述：本专利技术通过提供纯化目标蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.从混合物中纯化目标蛋白质的方法，包括以下步骤：a)在操作色谱循环中，将第一体积的含有目标蛋白质的混合物从第一容器装载到色谱基质中，操作使得蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％的色谱基质其被静态结合容量；b)在第二容器中收集含有未结合的目标蛋白质的流出物，和c)在进一步的操作色谱循环中，重新装载来自第二容器的流出物并将第二体积的目标蛋白质从第一容器装载到同一色谱基质中，其被操作使得目标蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％的色谱基质最大静态结合容量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.19 GB 1602938.11.从混合物中纯化目标蛋白质的方法，包括以下步骤：a)在操作色谱循环中，将第一体积的含有目标蛋白质的混合物从第一容器装载到色谱基质中，操作使得蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％的色谱基质其被静态结合容量；b)在第二容器中收集含有未结合的目标蛋白质的流出物，和c)在进一步的操作色谱循环中，重新装载来自第二容器的流出物并将第二体积的目标蛋白质从第一容器装载到同一色谱基质中，其被操作使得目标蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％的色谱基质最大静态结合容量。2.从混合物中纯化目标蛋白质的方法，包括以下步骤：a)在操作色谱循环中，将第一体积的含有目标蛋白质的混合物从第一容器装载到色谱基质中，其被操作使得超过色谱基质的动态结合容量；b)在第二容器中收集含有未结合的目标蛋白质的流出物，和c)在进一步的操作色谱循环中，重新装载来自第二容器的流出物并将第二体积的目标蛋白质从第一容器装载到同一色谱基质中，其被操作使得超过色谱基质的动态结合容量。3.根据权利要求2的方法，其中在步骤(a)中，当达到至少40％的最大静态结合容量时，停止装载目标蛋白质。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：M·H·罗斯，
申请(专利权)人：UCB生物制药私人有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时,BE